P элемент - P element

п элементы находятся сменные элементы которые были обнаружены в Дрозофила как возбудители генетических признаков называют гибридная дисгенезия. Транспозон отвечает за п черта п элемент, и он встречается только у диких мух. Они также встречаются у многих других эукариот.[1]

В п элемент кодирует белок п транспозаза. Считается, что в отличие от самок лабораторных штаммов, самки дикого типа также экспрессируют ингибитор п transposase из того же элемента. Этот ингибитор снижает нарушение геном вызвано п элементы, позволяющие производить потомство. Доказательства этого получены при скрещивании лабораторных самок (у которых отсутствуют п ингибитор транспозазы) с самцами дикого типа (у которых п элементы). В отсутствие ингибитора п элементы могут размножаться по всему геному, нарушая многие гены и убивая потомство.

п элементы обычно используются в качестве мутагенных агентов в генетических экспериментах с Дрозофила. Одним из преимуществ этого подхода является то, что мутации легко обнаружить. При гибридном дисгенезе один штамм Дрозофила спаривается с другим штаммом Дрозофила производят гибридное потомство и вызывают хромосомные повреждения, которые, как известно, являются дисгенными. Гибридная дисгенезия требует участия обоих родителей. Например, в ВЕЧЕРА система, где п напряжение способствует отцовской и M напряжение влияет на материнское состояние, может возникнуть дисгенезия. Обратный крест, с M цитотип отца и п мать, дает нормальное потомство, так как скрещивается в п Икс п или M Икс M манера. п мужские хромосомы могут вызвать дисгенезию при скрещивании с M женский.

Характеристики

В п элемент II класса транспозон, и движется с помощью основанного на ДНК механизма «вырезать и вставить». Последовательность состоит из 4 экзоны с 3 интроны.[2] Полный сплайсинг интронов производит фермент транспозазу, в то время как альтернативный частичный сплайсинг интрона 1 и 2, оставляющий только интрон 3, кодирует п элемент репрессора. Полный, автономный п элемент кодирует транспозаза фермент, который признает 31 бп Терминал перевернутые повторы из п элемент и катализаторы п удаление и повторная вставка элемента. Полный элемент - 2907 п.н .; неавтономный п элементы содержат внутреннюю делецию различной длины, которая отменяет продукцию транспозазы, но такие элементы все еще могут быть мобилизованы, если транспозаза кодируется в другом месте в геном. п вставка элемента и последующее вырезание приводит к образованию прямых повторов длиной 8 п.н., и наличие таких повторов указывает на предыдущие п активность элемента.

Все п элементы имеют каноническую структуру, содержащие 31 п.н. перевернутые повторы и 11 п.н. внутренних инвертированных повторов, расположенных в THAP-домене транспозаза. Самый короткий и самый длинный п элементы неавтономные элементы. Самый длинный п элементы кодируют транспозазу, необходимую для транспозиции. п также кодирует подавитель транспозиции, который накапливается в цитоплазма во время развития клеток. Таким образом, при скрещивании самца P или M с самкой P женская цитоплазма содержит супрессор, который связывается с любым п элементы и предотвращает их перемещение.

Гибридная дисгенезия

Гибридный дисгенез относится к высокой скорости мутации в линия зародыша ячейки Дрозофила штаммы, полученные в результате скрещивания самцов с автономными п элементы (п Напряжение/п цитотип) и самок, у которых отсутствует п элементы (M Напряжение/M цитотип). Синдром гибридного дисгенеза характеризуется зависящей от температуры стерильностью, повышенным уровнем мутаций и увеличением хромосомной перестройки и рекомбинации.

Фенотип гибридной дисгенезии зависит от транспозиции п элементы в клетках зародышевой линии потомства п штамм самцов с M штамм самок. Транспозиция происходит только в клетках зародышевой линии, потому что сращивание событие необходимо сделать транспозаза мРНК не встречается в соматических клетках.

Гибридная дисгенезия проявляется при скрещивании п штамм самцов с M деформировать самок, а не при скрещивании п штамм самок (самок с автономными п элементы) с M штамм самцов. Яйца п самки штамма содержат большое количество репрессор белок, который предотвращает транскрипция гена транспозазы. Яйца M материнские штаммы, не содержащие репрессорный белок, допускают транспозицию п элементы из спермы отцов. В п штамма самок репрессоры обнаруживаются в цитоплазме. Следовательно, когда п штамм самцов удобрять M штамм самок (чья цитоплазма не содержит репрессора), самец вносит свой геном с п элемент, но не мужскую цитоплазму, ведущую к п штамм-потомство.[2]

Этот эффект способствует наследованию piРНК только по материнской линии, что обеспечивает механизм защиты от п элементы.[3]

Использование в молекулярной биологии

В п элемент нашел широкое применение в Дрозофила исследования как мутаген. В системе мутагенеза обычно используются автономный, но неподвижный элемент и мобильный неавтономный элемент. Затем мух последующих поколений можно подвергнуть скринингу по фенотипу или ПЦР. Встречающиеся в природе п элементы содержат кодирующую последовательность для фермента транспозазы и последовательности распознавания для действия транспозазы. Транспозаза регулирует и катализирует удаление п элемент из ДНК хозяина, разрезая на двух сайтах распознавания, а затем повторно вставляя случайным образом. Это случайная вставка, которая может мешать существующим генам или нести дополнительный ген, который можно использовать для генетических исследований.

Чтобы использовать это как полезный и управляемый генетический инструмент, две части п элемент должен быть разделен, чтобы предотвратить неконтролируемое перемещение. Обычные генетические инструменты - это ДНК, кодирующая транспозазу без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться, и "п Плазмида ». п Плазмиды всегда содержат Дрозофила репортерный ген, часто маркер красных глаз (продукт белый ген) и последовательности распознавания транспозаз. Они могут содержать интересующий ген, Кишечная палочка выбираемый маркер ген, часто какой-то устойчивость к антибиотикам, начало репликации или другие связанные плазмида "хозяйственные" последовательности.

Способы использования

Эти инструменты можно использовать двумя способами:

Трансформация мухи

  1. Клонировать п элемент в плазмиду и трансформирует и выращивает его в бактериях.
  2. Устранить п транспозазу и замените ее интересующим вас геном.
  3. Microinject задний конец ранней стадии (пре-клеточность) эмбрион с ДНК, кодирующей транспозазу, и плазмидой с репортерным геном, представляющим интерес геном и последовательностями распознавания транспозазы.
  4. Происходит случайная транспозиция, вставляя интересующий ген и репортерный ген.
  5. После того, как интересующий ген был вставлен, он больше не подвижен, потому что не может производить свой собственный п транспозаза.
  6. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. Будем надеяться, что некоторые из этих трансформированных клеток окажутся в зародышевой линии. Трансформированная гамета даст начало организму без изменений между его клетками).
  7. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут вставленный интересующий ген, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за интересующего гена.

Вставленный ген мог нарушить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

Вставной мутагенез

  1. Микроинъекцию эмбриона с ДНК, кодирующей транспозазу, и плазмиду с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (и часто Кишечная палочка репортерный ген и начало репликации и т. д.).
  2. Происходит случайная транспозиция, случайным образом вставляя репортерный ген. Встраивание обычно происходит рядом с активно транскрибируемыми генами, так как именно здесь хроматин структура самая рыхлая, поэтому ДНК наиболее доступна.
  3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма (см. Выше).
  4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они прошли успешную транспозицию, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа, обусловленного мутация существующих генов.

Возможные мутации:

  1. Вставка в транслируемую область => гибридный белок / усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются более сложные эффекты.
  2. Вставка в интрон => переделана сращивание сбой шаблона / сращивания. Обычно приводит к усечению белка или образованию неактивных неправильно сплайсированных продуктов, хотя обычно наблюдаются более сложные эффекты.
  3. Вставка в 5 '(последовательность, которая станет 5' UTR мРНК) нетранслируемой области => усечение транскрипта. Обычно приводит к тому, что мРНК не содержит Крышка 5 футов, что снижает эффективность перевода.
  4. Вставка в промотор => уменьшение / полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня производства протеина. Самый полезный вид прошивки для анализа из-за простоты ситуации.
  5. Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами => потеря функции энхансера / захват функции энхансера для репортерного гена. † Как правило, снижает уровень специфичности белка к типу клетки, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.
Захват усилителя
Основная статья: Ловушка усилителя

Захват энхансера из другого гена позволяет анализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, может использоваться для помощи в картировании экспрессии мутированного гена в организме и является очень мощным инструментом. Это полезный инструмент для изучения паттернов экспрессии генов (во времени и в пространстве).

Другое использование

Эти методы называются обратной генетикой. Обратная генетика - это подход к обнаружению функции гена путем анализа фенотипических эффектов конкретных последовательностей генов, полученных путем секвенирования ДНК.

Анализ продуктов мутагенеза

После определения функции мутированного белка можно секвенировать / очистить / клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

Обратная ПЦР

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, с помощью ПЦР.
Основная статья: Обратная ПЦР
  1. Изолируйте геном мухи.
  2. Пройдите легкий переваривание (используя фермент [фермент 1], который, как известно, НЕ разрезает репортерный ген), с получением фрагментов в несколько килобаз, некоторые из которых содержат вставку и ее фланкирующую ДНК.
  3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат вставку и ее фланкирующую ДНК.
  4. Разрежьте плазмиды в какой-то момент репортерного гена (с помощью фермента [фермента 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но известен как репортерный ген).
  5. Используя праймеры для секций репортерного гена, ДНК можно амплифицировать для последовательность действий.

Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив участок разреза [фермента 1].

Спасение плазмид

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, путем спасения плазмиды.
  1. Изолируйте геном мухи.
  2. Пройдите легкий переваривание (используя фермент [фермент 1], который, как известно, разрезает границу между репортерным геном и Кишечная палочка репортерного гена и плазмидных последовательностей), давая фрагменты в несколько килобаз, некоторые из которых Кишечная палочка репортер, последовательности плазмиды и ее фланкирующая ДНК.
  3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых имеют Кишечная палочка репортер, последовательности плазмиды и ее фланкирующая ДНК.
  4. Вставьте плазмиды в Кишечная палочка клетки (например, электропорацией).
  5. Выберите плазмиды для Кишечная палочка выбираемый маркер ген. Только успешные вставки плазмид с последовательностями «домашнего хозяйства» плазмиды будут экспрессировать этот ген.
  6. Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

Рекомендации

  • Леланд Хартвелл и др .. 2004. Генетика - от генов к геномам 2-е издание. Макгроу-Хилл
  • Энгельс, В. P-элементы у дрозофилы
  1. ^ Маджумдар, S; Рио, округ Колумбия (апрель 2015 г.). «Р-мобильные элементы у дрозофилы и других эукариотических организмов». Микробиологический спектр. 3 (2): MDNA3–0004–2014. Дои:10.1128 / microbiolspec.MDNA3-0004-2014. ЧВК  4399808. PMID  26104714.
  2. ^ а б Гриффитс, А. Дж. (2005). Введение в генетический анализ. Макмиллан.
  3. ^ Brennecke, J .; и другие. (2008). «Эпигенетическая роль унаследованных от матери piRNAs в подавлении транспозонов». Наука. 322 (5906): 1387–1392. Bibcode:2008Sci ... 322.1387B. Дои:10.1126 / science.1165171. ЧВК  2805124. PMID  19039138.

внешняя ссылка