Бесклеточный протеиновый массив - Cell-free protein array

Бесклеточный протеиновый массив технология производит белковые микрочипы выполняя in vitro синтез целевых белков из их ДНК шаблоны. Этот метод синтеза белковых микрочипов преодолевает множество препятствий и проблем, с которыми сталкиваются традиционные методы производства белковых массивов.[1] которые предотвратили широкое внедрение белковых микрочипов в протеомика. Белковые массивы, изготовленные по этой технологии, можно использовать для тестирования. белок-белковые взаимодействия, а также взаимодействия белков с другими клеточными молекулами, такими как ДНК и липиды. Другие применения включают анализ ферментативного ингибирования и скрининг специфичности антител.

Обзор / история вопроса

Безудержный успех ДНК-микрочипы вызвал большой энтузиазм в отношении белковых микрочипов. Однако белковые микроматрицы не совсем появились, как ожидалось, даже при наличии необходимых инструментов и ноу-хау из ДНК-микрочипов, готовых к адаптации. Одна из основных причин заключается в том, что белковые микрочипы намного труднее и технически сложнее сконструировать, чем ДНК-микрочипы.

Традиционные методы производства белковых массивов требуют отдельного in vivo экспрессия сотен или тысяч белков с последующей отдельной очисткой и иммобилизацией белков на твердой поверхности. Технология бесклеточных протеиновых массивов пытается упростить конструирование протеиновых микроматриц, избегая необходимости экспрессировать протеины в бактерии клетки и последующая их очистка. Он использует доступные бесклеточный синтез белка технология, которая продемонстрировала, что синтез белка может происходить без интактной клетки, если клеточные экстракты содержат матрицу ДНК, транскрипция и перевод предоставляется сырье и оборудование.[2] Общие источники клеточных экстрактов, используемых в технологии бесклеточных протеиновых массивов, включают: ростки пшеницы, кишечная палочка, и кролик ретикулоцит. Экстракты клеток из других источников, таких как гипертермофилы, гибридомы, Xenopus ооциты также использовались клетки насекомых, млекопитающих и человека.[3]

Целевые белки синтезируются на месте на белковом микрочипе, прямо из матрицы ДНК, таким образом пропуская многие этапы производства традиционных белковых микрочипов и связанные с ними технические ограничения. Что еще более важно, экспрессия белков может происходить параллельно, что означает, что все белки могут экспрессироваться вместе в одной реакции. Эта способность мультиплексировать экспрессию белка существенно экономит время в производственном процессе.

Методы синтеза

На месте методы

в на месте метод, синтез белка осуществляется на поверхности массива белков, которая предварительно покрыта реагентом, захватывающим белок, или антитело. Как только вновь синтезированные белки высвобождаются из рибосома, то последовательность тегов который также синтезируется на N- или C-конец каждого растущего белка будет связываться захватывающим реагентом или антителом, таким образом иммобилизуя белки с образованием массива. Обычно используемые теги включают полигистидин (Его) 6 и глутатион-s-трансфераза (GST).

Различные исследовательские группы разработали свои собственные методы, каждая из которых отличается своим подходом, но их можно разделить на 3 основные группы.

Схема НАППА

Программируемый протеиновый массив нуклеиновых кислот (NAPPA)

НАППА[4] использует матрицу ДНК, которая уже была иммобилизована на той же поверхности захвата белка. Матрица ДНК биотинилированный и обязан авидин который предварительно нанесен на поверхность захвата белка. Вновь синтезированные белки, которые помечены GST, затем иммобилизуют рядом с ДНК-матрицей путем связывания с соседним поликлональным захватывающим антителом против GST, которое также предварительно наносится на поверхность захвата. Главный недостаток этого метода - дополнительные и утомительные подготовительные шаги в начале процесса: (1) клонирование из кДНК в готовом выражении вектор; и (2) необходимость биотинилирования плазмида ДНК, но не мешать транскрипции. Более того, полученный массив белков не является «чистым», потому что белки локализованы совместно со своими матрицами ДНК и захватывают антитела.[3]

Схема PISA

Протеин на месте массив (PISA)

В отличие от НАППА, PISA[5] полностью обходит иммобилизацию ДНК, поскольку матрица ДНК добавляется в реакционную смесь в виде свободной молекулы. В 2006 году другая группа доработала и уменьшила этот метод, используя технику множественных пятен, чтобы определить матрицу ДНК и смесь внеклеточной транскрипции и трансляции на белковой микроматрице высокой плотности с количеством точек до 13000.[6] Это стало возможным благодаря автоматизированной системе, используемой для точной и последовательной подачи реагентов для реакции транскрипции / трансляции, происходящей в небольших субнанолитровых каплях.

Схема На месте пуромицин-захват

На месте пуромицин-захват

Этот метод является адаптацией отображение мРНК технологии. ПЦР ДНК сначала транскрибируется в мРНК, и одноцепочечная ДНК олигонуклеотид изменен с биотин и пуромицин на каждом конце затем гибридизируется с 3’-концом мРНК. Затем мРНК наносят на предметное стекло и иммобилизуют путем связывания биотина с стрептавидин который предварительно нанесен на слайд. Затем клеточный экстракт наносится на предметное стекло для на месте перевод состоится. Когда рибосома достигает гибридизированного олигонуклеотида, она останавливается и включает молекулу пуромицина в зарождающийся полипептид цепи, тем самым прикрепляя вновь синтезированный белок к микроматрице через олигонуклеотид ДНК.[7] Чистый белковый массив получают после того, как мРНК расщепляется РНКаза. Белковые пятна, создаваемые этим методом, очень четко очерчены и могут быть получены с высокой плотностью.

Формат массива нано-лунок

Рисунок 4: Принципиальная схема формата массива нанолуночек

Форматы массивов нанолунок используются для экспрессии отдельных белков в небольших реакционных сосудах или нанолунках.[8][9] (Рисунок 4). Этот формат иногда является предпочтительным, поскольку он позволяет избежать необходимости иммобилизовать целевой белок, что может привести к потенциальной потере активности белка. Миниатюризация массива также позволяет экономить раствор и ценные соединения, которые могут использоваться в скрининговых анализах. Кроме того, структурные свойства отдельных колодцев помогают предотвратить перекрестное загрязнение камер. В 2012 году была опубликована улучшенная НАППА, в которой для предотвращения диффузии использовалась матрица нанолун. Здесь ДНК иммобилизовали в лунке вместе с антителом против GST. Затем добавляли смесь для бесклеточной экспрессии и лунки закрывали крышкой. Возникающие белки, содержащие GST-метку, были связаны с поверхностью лунки, что позволило получить массив NAPPA с более высокой плотностью и почти без перекрестного загрязнения.[10]

Массив ДНК в массив белков (DAPA)

Рисунок 5: Принципиальная схема DAPA

ДНК-матрица в белковый массив (DAPA) - это метод, разработанный в 2007 году для многократного создания белковых массивов путем «печати» их из единого массива ДНК-матрицы по запросу.[11] (Рисунок 5). Он начинается с нанесения и иммобилизации массива шаблонов ДНК на предметном стекле. Затем слайд собирают лицом к лицу со вторым слайдом, предварительно покрытым реагентом, захватывающим белок, и мембрану, пропитанную клеточным экстрактом, помещают между двумя слайдами для транскрипции и трансляции. Затем вновь синтезированные гистид-меченые белки иммобилизуют на предметном стекле для формирования массива. При публикации в 18 из 20 повторов могла быть создана копия микрочипа белка. Потенциально процесс можно повторять столько раз, сколько необходимо, пока ДНК не будет повреждена ДНКазами, деградацией или механическим истиранием.

Преимущества

Многие из преимуществ технологии бесклеточного белкового массива обращаются к ограничениям клеточной системы экспрессии, используемой в традиционных методах производства белковых микрочипов.

Быстро и экономично

Этот метод позволяет избежать клонирования ДНК (за исключением NAPPA) и может быстро преобразовать генетическую информацию в функциональные белки с помощью ПЦР ДНК. Уменьшение количества этапов производства и возможность миниатюризации системы позволяют сэкономить на расходе реагентов и сократить производственные затраты.

Повышает доступность белка

Многие белки, включая антитела, трудно экспрессировать в клетках-хозяевах из-за проблем с их нерастворимостью, дисульфид связи или токсичность для клетки-хозяина.[1] Бесклеточный протеиновый массив делает многие из таких протеинов доступными для использования в протеиновых микрочипах.

Обеспечивает долгосрочное хранение

В отличие от ДНК, которая представляет собой высокостабильную молекулу, белки представляют собой гетерогенный класс молекул с различной стабильностью и физико-химическими свойствами. Сохранение сворачивания и функции белков в иммобилизованном состоянии в течение длительных периодов хранения является серьезной проблемой для белковых микрочипов. Бесклеточные методы позволяют быстро получать белковые микрочипы по запросу, что устраняет любые проблемы, связанные с долгосрочным хранением.

Гибкий

Метод подходит для ряда различных шаблонов: продуктов ПЦР, плазмид и мРНК. Дополнительные компоненты могут быть включены во время синтеза для регулирования среды для сворачивания белка, образования дисульфидной связи, модификации или активности белка.[3]

Ограничение

  • Посттрансляционная модификация белков в белках, образующихся в результате внеклеточного синтеза белка [12] все еще ограничен по сравнению с традиционными методами,[13] и может быть не столь биологически значимым.

Приложения

Взаимодействие с белками: для выявления белок-белковые взаимодействия[4] и взаимодействия белков с другими молекулами, такими как метаболиты, липиды, ДНК и малые молекулы .;[14] анализ ингибирования ферментов:[8] для высокопроизводительного скрининга кандидатов на лекарственные препараты и открытия новых ферменты для использования в биотехнология; скрининг специфичности антител.[15]

использованная литература

[16]

  1. ^ а б Стивенс, Р. К. (2000). «Разработка высокопроизводительных методов производства белка для структурной биологии». Состав 8 (9): R177-R185.
  2. ^ Katzen, F., G. Chang, et al. (2005). «Прошлое, настоящее и будущее бесклеточного синтеза белка». Trends Biotechnol 23 (3): 150–6.
  3. ^ а б c He, M., O. Stoevesandt, et al. (2008). «Синтез белковых массивов in situ». Curr Opin Biotechnol 19 (1): 4–9.
  4. ^ а б Рамачандран, Н., Э. Хейнсворт и др. (2004). «Самособирающиеся микроматрицы белков». Science 305 (5680): 86–90.
  5. ^ Он, М. и М. Дж. Тауссиг (2001). «Одностадийное создание белковых массивов из ДНК путем бесклеточной экспрессии и иммобилизации in situ (метод PISA)». Nucleic Acids Res 29 (15): E73-3.
  6. ^ Angenendt, P., J. Kreutzberger, et al. (2006). «Создание микрочипов белков высокой плотности путем бесклеточной экспрессии in situ неочищенных продуктов ПЦР». Протеомика клеток Mol 5 (9): 1658–66.
  7. ^ Тао, С. К. и Х. Чжу (2006). «Изготовление протеиновых чипов путем захвата возникающих полипептидов». Nat Biotechnol 24 (10): 1253–4.
  8. ^ а б Angenendt, P., L. Nyarsik, et al. (2004). «Бесклеточная экспрессия белка и функциональный анализ в формате чипа нанолунок». Anal Chem 76 (7): 1844–9.
  9. ^ Кинпара Т., Мизуно Р. и др. (2004). «Массив пиколитровых камер для бесклеточного синтеза белка». J. Biochem. 136 (2): 149–54.
  10. ^ Такулапалли Б.Р., Цю Дж. И др. (2012). «Матрицы нанокарманов высокой плотности без диффузии». J Proteome Res. 11 (8): 4382-91
  11. ^ He, M., O. Stoevesandt, et al. (2008). «Печать массивов белков из массивов ДНК». Нат Методы 5 (2): 175–7.
  12. ^ Промега in vitro Руководство по выражению В архиве 7 ноября 2007 г. Wayback Machine
  13. ^ Чаттерджи, Д.К. и Дж. ЛаБаер (2006). «Белковые технологии». Curr Opin Biotech 17 (4): 334–336.
  14. ^ Он, М. и М. В. Ванги (2007). «Сборка белков путем бесклеточного синтеза». Biomol Eng 24 (4): 375–80.
  15. ^ Он, М. и М. Дж. Тауссиг (2003). «Технология DiscernArray: бесклеточный метод создания белковых массивов из ДНК ПЦР». J Immunol Methods 274 (1-2): 265-70.
  16. ^ [1].

внешние ссылки