Кометный анализ - Comet assay

Снимок экрана приложения CaspLab Comet Assay

В одноклеточный гель-электрофорез (SCGE, также известный как кометный анализ) - несложный и чувствительный метод обнаружения Повреждение ДНК на уровне личности эукариотический клетка. Впервые он был разработан Östling & Johansson в 1984 году, а затем модифицирован Сингхом. и другие. в 1988 г.[1] С тех пор он стал популярным как стандартный метод оценки повреждений / репарации ДНК, биомониторинга и тестирования генотоксичности. Он включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, лизис клеток в нейтральных или щелочных (pH> 13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. Термин «комета» относится к модели миграции ДНК через гель для электрофореза, которая часто напоминает комету.[2][3]

Кометный анализ (одноклеточный гель-электрофорез) - это простой метод измерения разрывов цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в эукариотических клетках. Клетки, внедренные в агарозу на предметном стекле микроскопа, лизируют детергентом и высоким содержанием соли с образованием нуклеоидов, содержащих суперспиральные петли ДНК, связанные с ядерным матриксом. Электрофорез при высоком pH приводит к образованию структур, напоминающих кометы, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии; Интенсивность кометного хвоста относительно головы отражает количество разрывов ДНК. Вероятное основание для этого состоит в том, что петли, содержащие разрыв, теряют свою сверхспиральность и могут свободно расширяться к аноду. Затем следует визуальный анализ с окрашиванием ДНК и вычислением флуоресценции для определения степени повреждения ДНК. Это может быть выполнено вручную или автоматически с помощью программного обеспечения для обработки изображений.[4][5]

Процедура

Инкапсуляция

Образец клеток, полученных из in vitro культура клеток или из in vivo испытуемый распределяется по отдельным ячейкам и суспендируется в расплаве с низкой температурой плавления. агароза при 37 ° С. Эта моноподвеска отлита на предметное стекло микроскопа. Стекло покровное стекло удерживается под углом, и моновесия применяется к точке контакта покровного стекла и предметного стекла. Когда покровное стекло опускается на предметное стекло, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Агароза превращается в гель при 4 ° C и покровное стекло удаляется.

Агароза образует матрицу из углевод волокна, которые инкапсулируют клетки, закрепляя их на месте. Агарозой считается осмотический -нейтрально, поэтому решения может проникать в гель и воздействовать на клетки без изменения положения клеток.

В in vitro исследование клеток будет подвергаться воздействию тестового агента - обычно УФ-излучение, ионизирующее излучение, или генотоксичный химический - чтобы вызвать повреждение ДНК в инкапсулированных клетках. За калибровка, пероксид водорода обычно используется для определения стандартизированного уровня повреждения ДНК.

Лизис

Затем слайды погружают в раствор, который заставляет клетки лизировать. Раствор для лизиса, часто используемый в анализе комет, состоит из высококонцентрированной водной соль (часто встречается столовая соль можно использовать) и моющее средство (Такие как Тритон Х-100 или же саркозинат ). В pH раствора для лизиса можно регулировать (обычно между нейтральным и щелочной pH) в зависимости от типа повреждения, которое исследует исследователь.

Водная соль разрушает белки и их паттерны связи внутри клетки, а также нарушение РНК содержимое ячейки. Моющее средство растворяет клеточные мембраны. Под действием лизирующего раствора клетки разрушаются. Все белки, РНК, мембраны и цитоплазматический и нуклеоплазматический составляющие разрушаются и диффундируют в матрицу агарозы. Только ДНК клетки остается, и распадается, чтобы заполнить полость в агарозе, которую прежде заполняла вся клетка. Эта структура называется нуклеоидом (общий термин для структуры, в которой сосредоточена ДНК).

Электрофорез

После лизиса клеток (обычно 1-2 часа при 4 ° C) слайды промывают в дистиллированная вода удалить все соли и погрузить во второй раствор - электрофорез решение. Опять же, этот раствор можно регулировать pH в зависимости от типа исследуемого повреждения.

Слайды оставляют на ~ 20 минут в растворе для электрофореза перед проведением электрическое поле применяется. В щелочных условиях Двойная спираль ДНК является денатурированный и нуклеоид становится одноцепочечным.

Приложено электрическое поле (обычно 1 V /см ) на ~ 20 минут. Затем слайды нейтрализуют до pH 7, окрашивают ДНК-специфическая флуоресцентная окраска и проанализированы с помощью микроскоп с прикрепленной ПЗС-матрицей (устройство с зарядовой связью - по сути цифровая камера ), который подключен к компьютеру с анализ изображений программного обеспечения.

Фон

Концепция, лежащая в основе анализа SCGE, заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоорганизованную ассоциацию с матричными белками в ядре. При повреждении эта организация нарушается. Отдельные нити ДНК теряют свою компактную структуру и расслабляются, расширяясь из полости в агарозу. При приложении электрического поля ДНК, которая имеет общий отрицательный заряд, притягивается к положительно заряженному аноду. Неповрежденные цепи ДНК слишком велики и не покидают полость, тогда как чем меньше размер фрагментов, тем дальше они могут двигаться за определенный период времени. Таким образом, количество ДНК, которая покидает полость, является мерой степени повреждения ДНК в клетке.

Анализ изображений измеряет общую интенсивность флуоресценции всего нуклеоида и флуоресценцию мигрированной ДНК и сравнивает два сигнала. Чем сильнее сигнал от перемещенной ДНК, тем больше повреждений. Общая структура напоминает комета (отсюда и «кометный анализ») с круглой головкой, соответствующей неповрежденной ДНК, которая остается в полости, и хвостом поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем выше уровень повреждений.

Кометный анализ - это универсальный метод обнаружения повреждений, который с корректировкой протокола может использоваться для количественной оценки наличия широкого спектра повреждений (повреждений), изменяющих ДНК. Обычно обнаруживаются разрывы одиночных и двойных нитей. Иногда говорится[6][7] который щелочной Условия и полная денатурация ДНК необходимы для обнаружения разрывов одной нити. Однако это не так, как одно-, так и двухцепочечные разрывы также обнаруживаются в нейтральных условиях.[8][9][10][11] Однако в щелочных условиях дополнительные структуры ДНК обнаруживаются как повреждение ДНК: Сайты AP (базовые сайты отсутствуют либо пиримидин или же пурин нуклеотид ) и сайты, где иссечение происходит.[12][13]

Кометный анализ - это чрезвычайно чувствительный анализ повреждений ДНК. С этой чувствительностью нужно обращаться осторожно, поскольку она также уязвима для физических изменений, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов. По сути, следует избегать всего, что может вызвать повреждение или денатурацию ДНК, за исключением исследуемых факторов.[14] Наиболее распространенной формой анализа является щелочная версия, хотя пока нет окончательного протокола щелочного анализа. Благодаря простой и недорогой настройке его можно использовать в условиях, когда недоступны более сложные анализы.

Приложения

К ним относятся тестирование генотоксичности, биомониторинг человека и молекулярная эпидемиология, экогенотоксикология, а также фундаментальные исследования повреждений и восстановления ДНК.[15]

Фрагментация ДНК сперматозоидов

Кометный анализ может определить степень Фрагментация ДНК в сперматозоидах. Степень фрагментации ДНК была связана с результатами экстракорпоральное оплодотворение.[16][17]

Комета была модифицирована для использования со сперматозоидами в качестве инструмента диагностики мужского бесплодия. [18][19][20]

Чтобы разрушить эти прочно связанные белки протамина, чтобы использовать комету для спермы, требуются дополнительные шаги в протоколе деконденсации.[19]

Рекомендации

  1. ^ Singh, Narendra P .; Маккой, Майкл Т .; Тайс, Раймонд Р .; Шнайдер, Эдвард Л. (1988-03-01). «Простой метод количественного определения низких уровней повреждения ДНК в отдельных клетках». Экспериментальные исследования клеток. 175 (1): 184–191. Дои:10.1016/0014-4827(88)90265-0. ISSN  0014-4827.
  2. ^ Тайс, Р. Р. (2000). «Анализ одноклеточного геля / кометы: Руководство по генетическому токсикологическому тестированию in vitro и in vivo». Экологический и молекулярный мутагенез. 35 (3): 206–21. Дои:10.1002 / (SICI) 1098-2280 (2000) 35: 3 <206 :: AID-EM8> 3.0.CO; 2-J. PMID  10737956.
  3. ^ Нандхакумар, S; Парасураман, S; Шанмугам, М М; Рао, К. Р.; Чанд, П; Бхат, Б. В. (2011). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле одной клетки (анализ комет)». J Pharmacol Pharmacother. 2 (2): 107–11. Дои:10.4103 / 0976-500X.81903. ЧВК  3127337. PMID  21772771.
  4. ^ Коллинз, А. Р. (март 2004 г.). «Кометный тест на повреждение и восстановление ДНК: принципы, применение и ограничения». Мол. Биотехнология. 26 (3): 249–61. Дои:10.1385 / МБ: 26: 3: 249. PMID  15004294. S2CID  34355649.
  5. ^ Нандхакумар, S; Парасураман, S; Шанмугам, ММ; Рао, КР; Чанд, П; Bhat, BV (апрель 2011 г.). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле одной клетки (анализ комет)». J Pharmacol Pharmacother. 2 (2): 107–11. Дои:10.4103 / 0976-500X.81903. ЧВК  3127337. PMID  21772771.
  6. ^ Пу, Синьчжу; Ван, Цзэминь; Клауниг, Джеймс Э. (2015-08-06). «Щелочной анализ комет для оценки повреждения ДНК в отдельных клетках». Текущие протоколы токсикологии. 65: 3.12.1–11. Дои:10.1002 / 0471140856.tx0312s65. ISBN  978-0471140856. ISSN  1934-9262. PMID  26250399. S2CID  6105193.
  7. ^ Мёллер, Питер (апрель 2006 г.). «Щелочной анализ комет: к валидации в биомониторинге воздействия ДНК, повреждающего». Фундаментальная и клиническая фармакология и токсикология. 98 (4): 336–345. Дои:10.1111 / j.1742-7843.2006.pto_167.x. ISSN  1742-7835. PMID  16623855.
  8. ^ Беляев Игорь Ю; Эрикссон, Стефан; Нигрен, Йонас; Торудд, Джеспер; Хармс-Рингдал, Матс (5 августа 1999 г.). «Влияние бромистого этидия на организацию петли ДНК в лимфоцитах человека, измеренное с помощью зависимости аномальной вязкости от времени и электрофореза в геле одной клетки». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Общие предметы. 1428 (2–3): 348–356. Дои:10.1016 / S0304-4165 (99) 00076-8. ISSN  0304-4165. PMID  10434054.
  9. ^ Olive, P.L .; Banáth, J. P .; Дюран, Р. Э. (апрель 1990 г.). «Неоднородность в радиационно-индуцированном повреждении и восстановлении ДНК в опухолевых и нормальных клетках, измеренная с помощью« кометного »анализа». Радиационные исследования. 122 (1): 86–94. Bibcode:1990РадР..122 ... 86О. Дои:10.2307/3577587. ISSN  0033-7587. JSTOR  3577587. PMID  2320728.
  10. ^ Powell, S .; Макмиллан, Т.Дж. (1990-10-01). «Повреждение и восстановление ДНК после лечения ионизирующим излучением». Лучевая терапия и онкология. 19 (2): 95–108. Дои:10.1016 / 0167-8140 (90) 90123-Е. ISSN  0167-8140. PMID  2255771.
  11. ^ Воеводска, Мария; Бурачевска, Ивона; Крушевский, Марцин (27.06.2002). «Модифицированный анализ нейтральной кометы: устранение лизиса при высокой температуре и подтверждение анализа с использованием антител к одноцепочечной ДНК». Мутационные исследования. 518 (1): 9–20. Дои:10.1016 / с 1383-5718 (02) 00070-0. ISSN  0027-5107. PMID  12063063.
  12. ^ Коллинз, Эндрю Р. (1997-04-29). «Кометный анализ: что он может нам сказать?». Мутационные исследования / Фундаментальные и молекулярные механизмы мутагенеза. 375 (2): 183–193. Дои:10.1016 / S0027-5107 (97) 00013-4. ISSN  0027-5107. PMID  9202728.
  13. ^ Gedik, C.M .; Ewen, S.W .; Коллинз, А. Р. (сентябрь 1992 г.). «Электрофорез в геле одной клетки применяется для анализа повреждений УФ-С и его восстановления в клетках человека». Международный журнал радиационной биологии. 62 (3): 313–320. Дои:10.1080/09553009214552161. ISSN  0955-3002. PMID  1356133.
  14. ^ Обсуждаются теоретические и практические ограничения анализа, например, в Клауде и другие. (1996) и Коллинз и другие. (1997).
  15. ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf[постоянная мертвая ссылка ]
  16. ^ Саймон Л., Брунборг Г., Стивенсон М., Луттон Д., Макманус Дж., Льюис С.Е. (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в исходе вспомогательной репродукции». Hum Reprod. 25 (7): 1594–1608. Дои:10.1093 / humrep / deq103. PMID  20447937.
  17. ^ Награджаппа; Гангули, Анутош; Госвами, Уша (2006). «Повреждение ДНК в мужских половых клетках зеленой мидии (Perna viridis) при воздействии табачных изделий». Экотоксикология. 15 (4): 365–369. Дои:10.1007 / s10646-006-0077-1. PMID  16673160. S2CID  13956778.
  18. ^ Hughes CM, Lewis SEM, McKelvey-Martin V, Thompson W. Воспроизводимость измерений ДНК сперматозоидов человека с использованием анализа электрофореза в геле одной клетки. Мутационные исследования 1997 374:261-268.
  19. ^ а б Доннелли, штат Восточный; McClure, N; Льюис, SEM (1999). «Влияние добавок аскорбата и β-токоферола in vitro на целостность ДНК и вызванное перекисью водорода повреждение ДНК в сперматозоидах человека». Мутагенез. 14 (5): 505–511. Дои:10.1093 / mutage / 14.5.505. PMID  10473655.
  20. ^ Рибас-Майноу Хорди, Агустин Гарси'а-Пейро, Альба Фернандес-Энсинас, Мария Хосе Аменгуал и Бенет Хорди, разрывы ДНК в двухцепочечных сперматозоидах, измеренные с помощью анализа комет, связаны с необъяснимым повторным выкидышем у пар без женщины Фактор

дальнейшее чтение