PstI - PstI

Тихоокеанское стандартное времяя это тип II эндонуклеаза рестрикции выделен из грамотрицательных видов, Providencia stuartii.

Функция

Тихоокеанское стандартное времяЯ раскалываю ДНК в последовательности узнавания 5'-CTGCA / G-3 'образуют фрагменты с 3'-связными концами.[1] Это расщепление дает липкие концы 4 пары оснований в длину. PstI каталитически активен в виде димера. Две субъединицы связаны осью симметрии 2-го порядка, которая в комплексе с субстратом совпадает с осью диады последовательность распознавания. Он имеет молекулярную массу 69 500 и содержит 54 положительных и 41 отрицательно заряженный остаток.[2]

Последовательность распознаванияВырезать сайт
 5'CTGCAG 3 '3'GACGTC 5'
 5 '- CTGCA G - 3' 3 '- G ACGTC-5'

PstI система ограничения / модификации (R / M) состоит из двух компонентов: рестрикционного фермента, который расщепляет чужеродную ДНК, и метилтрансфераза которые защищают нативные цепи ДНК с помощью метилирование гистонов. Комбинация обоих обеспечивает механизм защиты от вторжения вирусов.[3] Метилтрансфераза и эндонуклеаза кодируются как два отдельных белка и действуют независимо. В системе PstI гены кодируются на противоположных цепях и, следовательно, должны быть записано расходится с отдельными промоутеры. Сайты инициации транскрипции разделены всего 70 пар оснований.[4] Задержка экспрессии эндонуклеазы по сравнению с метилазой связана с внутренними различиями двух белков.[5] Эндонуклеаза представляет собой димер, для сборки которого требуется второй этап, тогда как метилаза является мономером.

PstI функционально эквивалентен BsuBI. Оба фермента распознают целевую последовательность 5'CTGCAG. Ферментные системы имеют сходные метилтрансферазы (идентичность аминокислот 41%), эндонуклеазы рестрикции (идентичность аминокислот 46%) и генетический состав (идентичность нуклеотидов 58%).[6] Эти наблюдения указывают на то, что эволюционный история.

При исследовании предпочтительного двухцепочечного расщепления ДНК эндонуклеаза рестрикции PstI связывается с плазмидной ДНК pSM1.[7]

Клонирование ДНК

PstI является полезным ферментом для клонирования ДНК, поскольку он обеспечивает селективную систему для создания гибридных молекул ДНК.[8] Затем эти гибридные молекулы ДНК можно расщепить по регенерированным сайтам PstI. Его использование не ограничивается молекулярным клонированием; он также используется в картировании сайтов рестрикции, генотипировании, саузерн-блоттинге, полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (RFLP) и SNP.[9] Это также изошизомер рестрикционный фермент SalPI из Streptomyces albus P.[10]

Расщепление

PstI предпочтительно расщепляет очищенную ДНК pSM1 без влияния сверхсправедливости субстрата.[11] Однако неизвестно, возникают ли эффекты этого расщепления при связывании с сайтом узнавания или при расщеплении ДНК. Его дифференциальная скорость расщепления на разных сайтах рестрикции обусловлена ​​пятью особенностями дуплексной структуры. Близость к концам линейной молекулы ДНК, вариация последовательности ДНК в сайтах узнавания для ферментов, небольшое расстояние между участками необычных последовательностей ДНК и сайтами узнавания и, наконец, специальные структуры, такие как петли и шпильки. Коллективный эффект этих пяти факторов может повлиять на доступность рестрикционного фермента к его сайтам узнавания.

Связь

Рекомендации

  1. ^ «PstI (10 Ед / л) - Thermo Fisher Scientific». www.thermofisher.com. Получено 2016-04-29.
  2. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI». Журнал биологической химии. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  3. ^ Walder, R. Y .; Hartley, J. L .; Donelson, J. E .; Уолдер, Дж. А. (1981-03-01). «Клонирование и экспрессия системы рестрикционной модификации Pst I в Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 78 (3): 1503–1507. Bibcode:1981PNAS ... 78.1503W. Дои:10.1073 / pnas.78.3.1503. ISSN  0027-8424. ЧВК  319159. PMID  6262807.
  4. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI». Журнал биологической химии. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  5. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI». Журнал биологической химии. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  6. ^ Сюй, G L; Капфер, Вт; Уолтер, Дж; Траутнер, Т.А. (1992-12-25). «BsuBI - изоспецифическая система рестрикции и модификации PstI: характеристика генов и ферментов BsuBI». Исследования нуклеиновых кислот. 20 (24): 6517–6523. Дои:10.1093 / nar / 20.24.6517. ISSN  0305-1048. ЧВК  334566. PMID  1480472.
  7. ^ Армстронг, Карен (1982). «Предпочтительное сайт-зависимое расщепление рестрикционной эндонуклеазой PstI». Исследования нуклеиновых кислот. 10 (3): 993–1007. Дои:10.1093 / nar / 10.3.993. ЧВК  326216. PMID  6278444.
  8. ^ Боливар, Ф; Родригес, Р.Л .; Грин, П.Дж.; Betlach, MC; Heyneker, HL; Бойер, HW; Crosa, JH; Фалькоу, S (1977). «Строительство и характеристика новых клонирующих машин. II. Многоцелевая система клонирования». Ген. 2 (2): 95–113. Дои:10.1016/0378-1119(77)90000-2. PMID  344137.
  9. ^ «ПстИ».
  10. ^ Картер, Жаклин (1980). «Сравнение расщепления ДНК рестрикционными ферментами SalPI и PstI». Исследования нуклеиновых кислот. 8 (21): 4943–54. Дои:10.1093 / nar / 8.21.4943. ЧВК  324271. PMID  6255438.
  11. ^ Томас, М. (1975). «Исследования по расщеплению лямбда-ДНК бактериофага эндонуклеазой рестрикции EcoRI». Журнал молекулярной биологии. 91 (3): 315–328. Дои:10.1016/0022-2836(75)90383-6. PMID  1102702.