Рамановский микроскоп - Raman microscope

Фотография конфокального рамановского микроскопа
Конфокальный рамановский микроскоп
Фотография рамановского микроскопа с корпусом для образца
Рамановский микроскоп

В Рамановский микроскоп это лазер на основе микроскопический устройство, используемое для выполнения Рамановская спектроскопия.[1] Период, термин КРОТ (лазерный исследователь молекулярной оптики) используется для обозначения рамановского микрозонда.[1] Используемая техника названа в честь К. В. Раман открывший рассеивающие свойства в жидкостях.[2]

Конфигурация

Рамановский микроскоп начинается со стандартного оптический микроскоп, и добавляет возбуждение лазер, лазерные фильтры, а спектрометр или же монохроматор, и оптически чувствительный детектор например, устройство с зарядовой связью (CCD), или фотоумножитель, (PMT). Традиционно рамановская микроскопия использовалась для измерения рамановского спектра точки на образце, в последнее время этот метод был расширен для реализации рамановской спектроскопии для прямого химическая визуализация по всему полю зрения на 3D образец.

Режимы визуализации

В прямая визуализация, все поле зрения исследуется на предмет рассеяния в небольшом диапазоне волновых чисел (рамановские сдвиги). Например, характеристику волнового числа для холестерина можно использовать для регистрации распределения холестерина в культуре клеток. гиперспектральное изображение или же химическая визуализация, в котором тысячи рамановских спектров получены со всего поля зрения. Затем данные можно использовать для создания изображений, показывающих расположение и количество различных компонентов. Взяв пример клеточной культуры, гиперспектральное изображение может показать распределение холестерина,[3] а также белки, нуклеиновые кислоты и жирные кислоты.[4][5][6] Сложные методы обработки сигналов и изображений могут использоваться, чтобы игнорировать присутствие воды, питательных сред, буферов и других помех.

Разрешение

Рамановская микроскопия, и в частности конфокальная микроскопия, может достигать субмикрометрового поперечного пространственного разрешения.[7] Рамановский микроскоп - это дифракционно-ограниченная система, его пространственное разрешение зависит от длины волны света и числовая апертура фокусирующего элемента. В конфокальной рамановской микроскопии диаметр конфокальной апертуры является дополнительным фактором. Как показывает опыт, поперечное пространственное разрешение может достигать приблизительно длины волны лазера при использовании линз воздушного объектива, в то время как масляные или водные иммерсионные объективы могут обеспечивать поперечное разрешение примерно на половину длины волны лазера. Это означает, что при работе в диапазоне от видимого до ближнего инфракрасного диапазона рамановский микроскоп может достигать поперечного разрешения прибл. От 1 мкм до 250 нм, в то время как разрешение по глубине (если не ограничивается глубиной оптического проникновения образца) может варьироваться от 1-6 мкм с наименьшей конфокальной апертурой крошечного отверстия до 10s микрометров при работе без конфокального точечного отверстия.[8][9][10] Поскольку линзы объективов микроскопов фокусируют лазерный луч до микрометрового диапазона, результирующий поток фотонов намного выше, чем достигается в обычных рамановских установках. Это дает дополнительное преимущество в виде улучшенного фотообесцвечивание молекул, испускающих мешающую флуоресценцию. Однако высокий поток фотонов также может вызвать деградацию образца, и поэтому для каждого типа образца необходимо тщательно выбирать длину волны и мощность лазера.

Рамановская визуализация

Химическая визуализация фармацевтической эмульсии с помощью конфокальной рамановской микроскопии.
Химическое изображение фармацевтической эмульсии, полученное с помощью конфокальной рамановской микроскопии (микроскоп alpha300, WITec; синий: активный фармацевтический ингредиент, зеленый: масло, красный: примеси кремния).

Еще один инструмент, который становится все более популярным - это глобальная рамановская визуализация. Этот метод используется для определения характеристик крупномасштабных устройств, картирования различных соединений и изучения динамики. Он уже использовался для характеристики графен слои[11] J-агрегированные красители внутри углеродные нанотрубки и множество других 2D-материалов, таких как MoS2[12] и WSe2. Поскольку возбуждающий луч рассредоточен по всему полю зрения, эти измерения могут быть выполнены без повреждения образца. С помощью рамановской микроскопии in vivo можно измерять рамановские спектры с временным и пространственным разрешением микроскопических областей образцов. В результате можно удалить флуоресценцию воды, среды и буферов. Следовательно, целесообразно исследовать белки, клетки и органеллы.

Рамановская микроскопия для биологических и медицинских образцов обычно использует лазеры ближнего инфракрасного диапазона (NIR) (785 нм). диоды и 1064 нм Nd: YAG особенно распространены). Это снижает риск повреждения образца из-за воздействия более высоких длин волн. Однако интенсивность БИК комбинационного рассеяния света мала (из-за ω4 зависимость интенсивности комбинационного рассеяния), и для большинства детекторов требуется очень большое время сбора. В последнее время стали доступны более чувствительные детекторы, что сделало этот метод более пригодным для общего использования. Рамановская микроскопия неорганических образцов, таких как горные породы, керамика и полимеры,[13] может использовать более широкий диапазон длин волн возбуждения.

Родственная техника, Рамановская спектроскопия с усилением наконечника, может создавать гиперспектральные изображения одиночных молекул с высоким разрешением[14] и ДНК.[15]

Корреляционная рамановская визуализация

Корреляционная рамановская электронно-микроскопическая визуализация гематита.
Корреляционная рамановская электронно-микроскопическая микроскопия гематита (полученная с помощью микроскопа RISE, WITec). Рамановское изображение накладывается на СЭМ-изображение.

Конфокальную рамановскую микроскопию можно комбинировать с множеством других методов микроскопии. Используя разные методы и соотнося данные, пользователь достигает более полного понимания образца. Общие примеры методов корреляционной микроскопии: Раман-АСМ,[16][13] Раман-СБОМ,[17] и Раман-SEM.[18]

Корреляционная SEM-рамановская визуализация - это интеграция конфокального рамановского микроскопа в камеру SEM, которая позволяет получать корреляционные изображения с помощью нескольких методов, таких как SE, BSE, EDX, EBSD, EBIC, CL, AFM.[19] Образец помещается в вакуумную камеру электронного микроскопа. Оба метода анализа затем выполняются автоматически в одном и том же месте пробы. Затем полученные SEM и рамановские изображения могут быть наложены друг на друга.[20][21] Кроме того, добавив сфокусированный ионный пучок (FIB) на камере позволяет удалить материал и, следовательно, получить трехмерное изображение образца. Режим низкого вакуума позволяет анализировать биологические и непроводящие образцы.

Биологические приложения

Используя рамановскую микроскопию, in vivo Могут быть измерены рамановские спектры микроскопических областей образцов с временным и пространственным разрешением. Отбор проб является неразрушающим, и вода, среда и буферы обычно не мешают анализу. Как следствие, in vivo Рамановская спектроскопия с временным и пространственным разрешением подходит для исследования белки, клетки и органы. В области микробиологии конфокальная рамановская микроскопия использовалась для картирования внутриклеточного распределения макромолекул, таких как белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и полимерные включения, такие как поли-β-гидроксимасляная кислота и полифосфаты в бактериях и стеролы в микроводорослях. Объединение экспериментов по стабильному изотопному зондированию (SIP) с конфокальной рамановской микроскопией позволило определить скорость ассимиляции 13C и 15N-субстраты, а также D2O отдельными бактериальными клетками.[22]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Микроскопические методы при использовании рамановского микрозонда лазерной молекулярной оптики., М. Э. Андерсен, Р. З. Муггли, Аналитическая химия, 1981, 53 (12), стр 1772–1777 [1]
  2. ^ Кришнан, К. С .; Раман, К. В. (1928). «Новый тип вторичного излучения». Природа. 121 (3048): 501–502. Дои:10.1038 / 121501c0. ISSN  1476-4687.
  3. ^ Матфей, ​​Кристиан; Крафт, Кристоф; Дицек, Бенджамин; Brehm, Bernhard R .; Лорковски, Стефан; Попп, Юрген (2012-10-16). «Неинвазивная визуализация внутриклеточного метаболизма липидов в макрофагах с помощью рамановской микроскопии в сочетании со стабильной изотопной маркировкой». Аналитическая химия. 84 (20): 8549–8556. Дои:10.1021 / ac3012347. ISSN  0003-2700. PMID  22954250.
  4. ^ Баранска, Малгожата; Хлопицки, Стефан; Федорович, Анджей; Качамакова-Трояновская, Нели; Качор, Агнешка; Майзнер, Катажина (2012-12-10). «Трехмерная конфокальная рамановская визуализация эндотелиальных клеток и сосудистой стенки: перспективы в аналитической спектроскопии биомедицинских исследований». Аналитик. 138 (2): 603–610. Дои:10.1039 / C2AN36222H. ISSN  1364-5528. PMID  23172339.
  5. ^ Rygula, A .; Майзнер, К .; Marzec, K. M .; Качор, А .; Пиларчик, М .; Баранская, М. (01.08.2013). «Рамановская спектроскопия белков: обзор». Журнал Рамановской спектроскопии. 44 (8): 1061–1076. Дои:10.1002 / младший 4335. ISSN  1097-4555.
  6. ^ Czamara, K .; Майзнер, К .; Pacia, M. Z .; Кочан, К .; Качор, А .; Баранская, М. (01.01.2015). «Рамановская спектроскопия липидов: обзор». Журнал Рамановской спектроскопии. 46 (1): 4–20. Дои:10.1002 / jrs.4607. ISSN  1097-4555.
  7. ^ Топорский, Ян; Умирающий, Томас; Холлрихер, Олаф, ред. (2018). Конфокальная рамановская микроскопия. Серия Спрингера в науках о поверхности. 66. Дои:10.1007/978-3-319-75380-5. ISBN  978-3-319-75378-2. ISSN  0931-5195.
  8. ^ Нил Дж. Эбалайн (2009). «Конфокальная рамановская микроскопия: производительность, подводные камни и передовая практика». Прикладная спектроскопия. 63 (9): 245A – 262A. Дои:10.1366/000370209789379196. ISSN  1943-3530. PMID  19796478.
  9. ^ Вспомогательная информация из Т. Шмид; Н. Шефер; С. Левченко; Т. Риссом; Д. Абу-Рас (2015). «Картирование ориентации-распределения поликристаллических материалов с помощью рамановской микроскопии».. Научные отчеты. 5: 18410. Дои:10.1038 / srep18410. ISSN  2045-2322. ЧВК  4682063. PMID  26673970.
  10. ^ Лотар Опилик; Томас Шмид; Ренато Зеноби (2013). «Современная рамановская визуализация: колебательная спектроскопия на микрометрических и нанометровых шкалах». Ежегодный обзор аналитической химии. 6: 379–398. Дои:10.1146 / annurev-anchem-062012-092646. ISSN  1936-1335. PMID  23772660.
  11. ^ Шен, Цзэсян; Ю, Тинг; Ван, Иньин; Ни, Чжэньхуа (2008-10-01). «Рамановская спектроскопия и построение изображений графена». Нано исследования. 1 (4): 273–291. arXiv:0810.2836. Дои:10.1007 / s12274-008-8036-1. ISSN  1998-0000.
  12. ^ Ли, Хай; Лу, банда; Инь, Цзунъю; Он, Циюань; Ли, Хун; Чжан, Цин; Чжан, Хуа (12 марта 2012 г.). «Оптическая идентификация одно- и многослойных листов MoS2». Маленький. 8 (5): 682–686. Дои:10.1002 / smll.201101958. ISSN  1613-6829. PMID  22223545.
  13. ^ а б Schmidt, U .; Hild, S .; Ibach, W .; Холлрихер, О. (2005-12-01). «Характеристика тонких полимерных пленок в нанометровом масштабе с конфокальной рамановской АСМ». Макромолекулярные симпозиумы. 230 (1): 133–143. Дои:10.1002 / masy.200551152. ISSN  1521-3900.
  14. ^ Апкарян, В. Ара; Николас Талларида; Крэмптон, Кевин Т .; Ли, Джунхи (апрель 2019 г.). «Визуализация колебательных нормальных мод одиночной молекулы с атомарно ограниченным светом». Природа. 568 (7750): 78–82. Дои:10.1038 / s41586-019-1059-9. ISSN  1476-4687. PMID  30944493.
  15. ^ Он, Чжэ; Хан, Зехуа; Кизер, Меган; Линхардт, Роберт Дж .; Ван, Син; Синюков, Александр М .; Ван, Цзичжоу; Декерт, Фолькер; Соколов, Алексей В. (2019-01-16). «Рамановская визуализация одноцепочечной ДНК с улучшенным кончиком с разрешением одного основания». Журнал Американского химического общества. 141 (2): 753–757. Дои:10.1021 / jacs.8b11506. ISSN  0002-7863. PMID  30586988.
  16. ^ Пиларчик, Марта; Рыгула, Анна; Качор, Агнешка; Матеушук, Лукаш; Маслак, Эдита; Хлопицки, Стефан; Баранска, Малгожата (01.11.2014). «Новый подход к исследованию сосудистой стенки в 3D: комбинированная спектроскопия комбинационного рассеяния и атомно-силовая микроскопия для визуализации аорты на лице». Колебательная спектроскопия. 75: 39–44. Дои:10.1016 / j.vibspec.2014.09.004. ISSN  0924-2031.
  17. ^ Старк, Роберт В .; Хилленбранд, Райнер; Зиглер, Александр; Бауэр, Майкл; Хубер, Андреас Дж .; Гиглер, Александр М. (07.12.2009). «Наноразмерное картирование поля остаточных напряжений вокруг наноиндентов в SiC с помощью ИК s-SNOM и конфокальной рамановской микроскопии». Оптика Экспресс. 17 (25): 22351–22357. Дои:10.1364 / OE.17.022351. ISSN  1094-4087. PMID  20052158.
  18. ^ Карделл, Каролина; Герра, Изабель (01.03.2016). «Обзор новых систем SEM-EDX и рамановской спектроскопии с дефисами: приложения в биологии, окружающей среде и материаловедении». Тенденции TrAC в аналитической химии. 77: 156–166. Дои:10.1016 / j.trac.2015.12.001. ISSN  0165-9936.
  19. ^ Йируше, Ярослав; Ганичинец, Мартин; Гавелка, Милослав; Холлрихер, Олаф; Ибах, Вольфрам; Спизиг, Питер (2014). «Объединение сфокусированного ионного пучка - растрового электронного микроскопа с конфокальным рамановским микроскопом в одном приборе». Журнал Vacuum Science & Technology B, Нанотехнологии и микроэлектроника: материалы, обработка, измерения и явления. 32 (6): 06FC03. Дои:10.1116/1.4897502.
  20. ^ Холлрихер, Олаф; Шмидт, Юте; Бройнингер, Соня (ноябрь 2014 г.). "RISE Microscopy: Correlative Raman-SEM Imaging". Микроскопия сегодня. 22 (6): 36–39. Дои:10,1017 / с1551929514001175. ISSN  1551-9295.
  21. ^ Wille, G .; Lerouge, C .; Шмидт, У. (2018-06-01). «Мультимодальная микрохарактеризация зональности микроэлементов и кристаллографической ориентации в природном касситерите путем комбинирования катодолюминесценции, EBSD, EPMA и вклада конфокальной рамановской визуализации в SEM». Журнал микроскопии. 270 (3): 309–317. Дои:10.1111 / jmi.12684. ISSN  1365-2818. PMID  29336485.
  22. ^ Мэдиган, М.Т., Бендер, К.С., Бакли, Д.Х., Саттли, В.М. и Шталь, Д.А. (2018) Brock Biology of Microorganisms, Pearson Publ., NY, NY, 1022 стр.