Респирометрия - Respirometry - Wikipedia

Респирометрия - это общий термин, который включает в себя ряд методов для получения оценок скорости метаболизм из позвоночные, беспозвоночные, растения, ткани, клетки или микроорганизмы посредством косвенного измерения производства тепла (калориметрия ).

Скорость метаболизма всего животного

Метаболизм животного оценивается путем определения показателей углекислый газ производство (VCO2) и кислород потребление (VO2) отдельных животных либо в замкнутой, либо в открытой системе респирометрии. Обычно получают две меры: стандартные (SMR) или базальная скорость метаболизма (BMR) и максимальная скорость (VO2max ). SMR измеряется, когда животное находится в состоянии покоя (но не во сне), в определенных лабораторных условиях (температура, гидратация) и условиях конкретного субъекта (например, размер или аллометрия[1]), возраст, репродуктивный статус, постабсорбция, чтобы избежать термический эффект пищи ).[2] VO2max обычно определяется во время аэробных упражнений на физиологических пределах или около них.[3] Напротив, полевой уровень метаболизма (FMR) относится к скорости метаболизма необузданного, активного животного в природе.[4] К этим показателям относятся показатели метаболизма у всего животного без поправки на массу тела. Если значения SMR или BMR делятся на значение массы тела животного, то показатель называется массовым. Именно это массовое значение обычно слышно при сравнении видов.

Закрытая респирометрия

Респирометрия зависит от принципа «что входит, должно выходить».[5] Сначала рассмотрим закрытую систему. Представьте, что мы размещаем мышь в герметичную емкость. Воздух, запечатанный в баллоне, изначально содержит тот же состав и пропорции газов, которые присутствовали в помещении: 20,95%. О2, 0.04% CO2, водяной пар (точное количество зависит от температуры воздуха, см. точка росы ), 78% (приблизительно) N2, 0.93% аргон и различные следовые газы, составляющие остальные (см. Атмосфера Земли ). По прошествии времени мышь в камере образуется CO2 и водяной пар, но извлекает O2 из воздуха пропорционально его метаболическим потребностям. Следовательно, пока мы знаем объем системы, разница между концентрациями O2 и CO2 в начале, когда мы запечатали мышь в камеру (базовые или стандартные условия) по сравнению с количествами, присутствующими после мышь вдохнул воздух позже, должно быть количество CO2/ O2 произведено / потреблено мышь. Азот и аргон являются инертными газами, и поэтому их фракционные количества не меняются при дыхании мыши. В закрытой системе среда со временем станет гипоксический.

Открытая респирометрия

Для открытой системы проектные ограничения включают характеристики вымывания камеры для животных и чувствительность газоанализаторов.[6][7] Однако основной принцип остается прежним: то, что входит, должно выходить наружу. Основное различие между открытой и закрытой системами заключается в том, что открытая система пропускает воздух через камеру (т.е. воздух выталкивается или вытягивается насосом) со скоростью, которая постоянно пополняет запас кислорода.2 истощается животным при удалении CO2 и водяной пар, производимый животным. В объемный расход должен быть достаточно высоким, чтобы животное никогда не потребляло весь кислород, присутствующий в камере, в то же время скорость должна быть достаточно низкой, чтобы животное потребляло достаточно кислорода2 для обнаружения. Для 20 г мышь скорость потока около 200 мл / мин через контейнеры емкостью 500 мл обеспечит хороший баланс. При таком расходе около 40 мл O2 подается в камеру, и весь объем воздуха в камере заменяется в течение 5 минут. Для других более мелких животных объем камеры может быть намного меньше, а скорость потока также должна быть уменьшена. Обратите внимание, что для теплокровный или эндотермические животные (птицы и млекопитающие ), размеры камеры и / или скорости потока должны быть выбраны с учетом их более высокой скорости метаболизма.

Расчеты

Расчет ставок ВО2 и / или VCO2 требует знания скорости потока в камеру и из камеры, а также фракционных концентраций газовых смесей в камере для животных и из нее. Как правило, скорость метаболизма рассчитывается исходя из стационарных условий (т.е. предполагается, что скорость метаболизма животного является постоянной.[8]). Чтобы узнать ставки кислород потребляется, необходимо знать расположение расходомера относительно камеры для животных (если он расположен перед камерой, расходомер находится «вверх по потоку», если он расположен после камеры, расходомер находится «ниже по потоку»), а также присутствуют инертные газы (например, CO2, воды, метан, видеть инертный газ ).

Для открытой системы с расходомером выше по потоку вода (например, безводная сульфат кальция ) и CO2 (например, диоксид углерода адсорбент как Ascarite II, зарегистрированная торговая марка Arthur H. Thomas Co.) удалена до кислород анализатора, подходящее уравнение

Для открытой системы с расходомером ниже по потоку, водой и CO2 удалено до кислород анализатора, подходящее уравнение

куда

  • FR - это объемный расход, установленный на STP (см. Стандартные условия по температуре и давлению )
  • FвО2 - фракционное количество кислорода, присутствующего в втекущий воздушный поток (базовый или эталонный), и
  • FбывшийО2 - фракционное количество кислорода, присутствующего в бывшийтекущий воздушный поток (то, что животное потребляло относительно исходного уровня в единицу времени).

Например, значения BMR мыши весом 20 г (Mus musculus ) возможно FR = 200 мл / мин, а показания фракционной концентрации O2 от анализатора кислорода FвО2 = 0.2095, FбывшийО2 = 0,2072. Расчетная скорость потребления кислорода составляет 0,58 мл / мин или 35 мл / час. Предполагая энтальпия горения для O2 из 20,1джоули на миллилитр, мы бы тогда рассчитали производство тепла (и, следовательно, метаболизм) для мыши как 703,5 Дж / ч.

Оборудование для респирометрии

Для системы с открытым потоком список оборудования и частей длинен по сравнению с компонентами закрытой системы, но главное преимущество открытой системы состоит в том, что она позволяет непрерывно регистрировать скорость метаболизма. Риск гипоксии также намного меньше в открытой системе.

Насосы для воздушного потока

  • Вакуумный насос: необходим насос, чтобы проталкивать (то есть вверх по потоку) или втягивать (то есть ниже по потоку) воздух в камеру для животных и проточную систему респирометрии и через них.
  • Насос для пробы: для прокачки воздуха через анализаторы используется небольшой, стабильный и надежный насос.

Расходомер и контроллеры потока

  • Пузырьковые расходомеры: простой, но очень точный способ измерения расхода включает синхронизацию движения пузырьков мыльной пленки вверх по стеклянным трубкам между отметками известного объема.[9] Стеклянная трубка подсоединяется снизу (для выталкивающих систем) или вверху (для вытяжных систем) к воздушному потоку. Маленькая резинка пипетка Колба, прикрепленная к основанию трубки, действует как резервуар и система доставки мыльных пузырей. Операция проста. Во-первых, намочите поверхность стекла вдоль пути, по которому движутся пузырьки (например, нажмите на колбу так, чтобы обильное количество мыла вытолкнуло вверх по стеклу потоком воздуха), чтобы обеспечить поверхность практически без трения. Во-вторых, зажать лампочку так, чтобы образовался один чистый пузырек. С секундомером в руке запишите время, необходимое пузырю, чтобы пройти между отметками на стекле. Обратите внимание на объем, записанный на верхней отметке (например, 125 = 125 мл), разделите объем на время, необходимое для прохождения между отметками, и результатом будет скорость потока (мл / с). Эти инструменты можно купить в различных магазинах, но они также могут быть изготовлены из объемного стекла подходящего размера. пипетки.
  • Акриловые расходомеры: в некоторых случаях при высоких расходах мы можем использовать простые акриловые расходомеры (0–2,5 л / мин) для контроля расхода через метаболические камеры. Измерители расположены перед метаболическими камерами. Расходомеры просты в использовании, но их следует калибровать дважды в день для использования в системе респирометрии: один раз перед началом регистрации (но после того, как животное было запечатано внутри камеры !!) и еще раз в конце записи (перед животным удаляется из камеры). Калибровка должна выполняться с помощью пузырькового расходомера, поскольку калибровочные отметки на акриловых расходомерах являются приблизительными. Для правильной калибровки расхода помните, что необходимо регистрировать как барометрическое давление, так и температуру воздуха, проходящего через расходомер (который мы считаем равным комнатной температуре).
  • Счетчики массового расхода: Уравнения, необходимые для расчета скорости потребления кислорода или производства углекислого газа, предполагают, что скорости потока в камеры и из них точно известны. Мы используем массовые расходомеры, преимущество которых заключается в том, что значения расхода не зависят от температуры и давления воздуха. Следовательно, эти скорости потока можно считать приведенными к стандартным условиям (стандартная температура и давление). Мы измеряем и контролируем поток только в одном месте - ниже по потоку от камеры. Следовательно, мы должны предположить, что скорости притока и оттока идентичны. Однако во время создания системы респирометрии необходимо измерять скорость потока на всех этапах, через все соединения, чтобы проверить целостность потока.
  • Игольчатые клапаны: Массовые расходомеры можно приобрести с регуляторы массового расхода которые позволяют устанавливать скорость потока. Однако это дорого. В респирометрических исследованиях часто предпринимаются попытки измерить одновременно более одного животного, что потребует одной камеры на животное и, таким образом, контролируемого потока через каждую камеру. Альтернативным и более экономичным методом управления потоком может быть использование игольчатых клапанов из нержавеющей или углеродистой стали. Игольчатые клапаны и массовые расходомеры обеспечивают рентабельное средство для достижения желаемого расхода. Клапаны стоят около 20 долларов.

Трубки и камеры

  • Трубки и соединения: Для подключения компонентов респирометрической системы к камере для животных и от нее могут использоваться различные типы трубок. В зависимости от характеристик системы можно использовать различные виды гибких трубок. Ацетил, Bev-A-Line, Kynar, нейлон, трубки и соединители Tygon могут использоваться в тех частях системы, где окислительная атмосфера низка (например, только фоновые уровни озона); Тефлон Если ожидается присутствие значительного количества озона, рекомендуется использовать трубку, поскольку он инертен по отношению к озону. Тефлоновые трубки более дорогие и недостаточно гибкие.
  • Камеры обмена веществ: Камеры могут быть стеклянными банками с резиновыми пробками для крышек; цилиндры для шприцев для мелких животных и насекомых; или построен из Оргстекло. В идеале камеры должны быть построены из инертных материалов; например, акриловые пластмассы могут поглощать O2 и может быть плохим выбором для респирометрии с очень мелкими насекомыми.[10] Камеры должны быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечивать быстрое перемешивание газов внутри камеры. Простейшей метаболической камерой для маленького позвоночного может быть стеклянная банка с пробкой. Заглушки оснащены двумя портами: короткие удлинители тефлоновой трубки предназначены для линейных соединений. Удлинители тефлоновой трубки проталкиваются через перегородку, и соединение линии завершается прикреплением небольшого шлангового зажима к основанию удлинителя тефлоновой трубки. Кроме того, необходимо предусмотреть удлинение впускного отверстия внутри сосуда - это гарантирует, что газы выдыхаемого животного не вымываются входящим потоком. Животное запечатано внутри, а резиновая пробка удерживается на месте с помощью Липучка ремни. Если используется система, расположенная выше по потоку, любая утечка в метаболической камере приведет к потере воздуха животным и, следовательно, к занижению скорости метаболизма животного. Когда вы закрываете животное внутри метаболической камеры, необходимо обращать внимание на уплотнение. Чтобы обеспечить плотное прилегание, прежде чем закрывать крышку, плотно вставьте пробку в банку и убедитесь, что она ровная. Используйте 1-2 ремня (лучше 2) и плотно затяните. Камеры из акрила (плексигласа) будут построены для некоторых целей, но для обеспечения надлежащей посадки потребуются точные инженерные решения; прокладки помогут, а разумное использование плотно прилегающих хомутов минимизирует утечки.
  • Трубки для чистки: воду до и после камеры для животных необходимо удалить. В одном варианте можно использовать большую акриловую колонну Дриерит (8 сетка (масштаб), т.е. относительно грубый) перед (перед толкающим насосом, перед камерой для животных) для сушки набегающего воздушного потока и нескольких трубок с меньшим размером ячеек (10-20, т. Чтобы подготовить чистящую трубку, убедитесь, что на каждом конце трубки есть небольшое количество хлопка, чтобы частицы пыли не попадали в анализаторы. Используйте небольшое количество хлопка, скажем, около 0,005 г, ровно столько, чтобы пыль не попала в трубку. Большое количество хлопка блокирует поток воздуха, если он намокнет. Вылейте дриерит в пробирку с помощью воронки, постучите пробиркой о стол, чтобы плотно упаковать зерна (для увеличения площади поверхности - воздух + вода проходит через рыхлый дриерит, что требует частой смены скрубберов) и закройте крышкой небольшим количеством жидкости. хлопок. Для удаления углекислого газа] до и после камеры для животных используется Ascarite II (Ascarite II является зарегистрированным товарным знаком Arthur H. Thomas Co.). Аскарит II содержит NaOH, который является едким веществом (поэтому не допускайте попадания его на кожу и держите подальше от воды). Трубку для чистки готовят, помещая небольшое количество ваты в конец трубки, заполняя одну треть пути дриеритом 10-20 меш, добавляя небольшое количество ваты, а затем дополнительную треть трубки Аскаритом II. еще один слой хлопка, затем еще дриерита и закрытие трубки другим небольшим количеством хлопка. Постучите по трубке на скамейке по мере добавления каждого слоя, чтобы упаковать зерна. Примечание: дриерит можно использовать снова и снова (после нагревания в духовке), хотя это указывает на то, что дриерит потеряет цвет при повторной сушке; Аскарит II используется один раз и будет считаться опасные отходы.

Анализаторы

  • Углекислый газ анализатор: CO2 анализаторы обычно используют методы обнаружения на основе инфракрасного излучения, чтобы воспользоваться тем фактом, что CO2 поглощает инфракрасный свет и повторно излучает свет с более длинными волнами. Панельный измеритель на анализаторе отображает 0,01-10% CO.2 диапазон и выходное напряжение пропорционально CO2 концентрация также создается для записи данных.
  • Кислород Анализатор: Анализаторы кислорода, подходящие для респирометрии, используют различные кислородные датчики, включая гальванический ("температура окружающей среды"), парамагнитный, полярографический (Кларк электроды -типа), и цирконий («высокая температура») датчики. Гальванический O2 анализаторы используют топливная ячейка содержащий кислотный электролит, хэви-метал анод и тонкая газопроницаемая мембрана. Поскольку частичное давление из O2 у анода - ноль, O2 движется распространение к анод через мембрану со скоростью, пропорциональной окружающему O2 частичное давление. Топливный элемент вырабатывает напряжение, линейно пропорциональное O2 парциальное давление на мембране. Пока температура шкафа стабильна и поток воздуха через топливный элемент стабилен и находится в пределах допустимого диапазона, отклик будет 0,01% или лучше в зависимости от вспомогательной электроники, программного обеспечения и других факторов.

Наконец, типичным дополнением к системе будет компьютерная система сбора данных и управления. Вместо самописец, непрерывные записи потребления кислорода и / или производства углекислого газа ведутся с помощью аналого-цифровой преобразователь подключен к компьютеру. Программное обеспечение улавливает, фильтрует, преобразует и отображает сигнал в соответствии с потребностями экспериментатора. Множество компаний и частных лиц обслуживают респирометрическое сообщество (например, Соболиные системы, Qubit Systems, см. Также Warthog Systems).

Скорость митохондриального метаболизма

В организме кислород доставляется к клеткам, а в клетках - к митохондрии Митохондриальная респирометрия измеряет потребление кислорода митохондриями без участия всего живого животного и является основным инструментом для изучения функции митохондрий.[11] Таким респирометрическим исследованиям могут быть подвергнуты три различных типа образцов: изолированные митохондрии (из культур клеток, животных или растений); проницаемые клетки (из клеточных культур); и проницаемые волокна или ткани (от животных). В последних двух случаях клеточная мембрана становится проницаемой за счет добавления химикатов, избирательно оставляя митохондриальную мембрану нетронутой. Следовательно, химические вещества, которые обычно не могут проникнуть через клеточную мембрану, могут напрямую влиять на митохондрии. Благодаря проницаемости клеточной мембраны, клетка перестает существовать как живой, определенный организм, оставляя только митохондрии в качестве все еще функциональных структур. В отличие от респирометрии целого животного, митохондриальная респирометрия проводится в растворе, то есть образец суспендируется в среде. . Сегодня митохондриальная респирометрия в основном выполняется с использованием закрытых камер.

Закрытая камера

Образец, суспендированный в подходящей среде, помещается в герметично закрытую метаболическую камеру. Митохондрии приводятся в определенные «состояния» путем последовательного добавления субстратов или ингибиторов. Поскольку митохондрии потребляют кислород, концентрация кислорода падает. Это изменение концентрации кислорода регистрируется кислородным датчиком в камере. По скорости снижения уровня кислорода (с учетом поправки на диффузию кислорода) можно рассчитать частоту дыхания митохондрий.[11]

Приложения

Фундаментальные исследования

Функционирование митохондрий изучается в области биоэнергетика.[12] Функциональные различия митохондрий разных видов изучаются респирометрией как аспектом сравнительная физиология.[13][14]

Прикладное исследование

Митохондриальная респирометрия используется для изучения функции митохондрий в митохондриальные заболевания или заболевания с (предположительно) прочной связью с митохондриями, например сахарный диабет 2 типа,[15][16] ожирение[17] и рак.[18] Другие области применения, например, спортивная наука и связь между функцией митохондрий и старение.[19]

Оборудование

Обычное оборудование включает в себя герметичную метаболическую камеру, датчик кислорода и устройства для записи данных, перемешивания, термостатирования и способа введения химикатов в камеру. Как описано выше для респирометрии всего животного, выбор материалов очень важен.[11] Пластиковые материалы не подходят для камеры из-за их способности удерживать кислород. Когда пластиковые материалы неизбежны (например, для уплотнительных колец, покрытий мешалок или пробок), полимеры с очень низкой проницаемостью для кислорода (например, ПВДФ в отличие от, например, PTFE ) может быть использовано. Остаточная диффузия кислорода в материалы камеры или из них может быть обработана путем корректировки измеренных потоков кислорода для инструментального фонового потока кислорода. Весь прибор, состоящий из упомянутых компонентов, часто называют оксиграфом. Компании, предоставляющие оборудование для спирометрии всего животного, упомянутые выше, обычно не участвуют в митохондриальной респрометии. Сообщество обслуживается на самых разных уровнях цен и сложности такими компаниями, как Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences или Strathkelvin Instruments.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Уайт, К. Р. и Р. С. Сеймур. 2005. Аллометрическая шкала метаболизма млекопитающих. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1611-1619.
  2. ^ Блэкстер, К. 1989. Энергетический обмен у животных и человека. Издательство Кембриджского университета. ISBN  0-521-36931-2
  3. ^ Вейбель, Э. Р. и Х. Хоппелер. 2005. Шкала максимальной скорости метаболизма, вызванной физической нагрузкой, с учетом аэробной способности мышц. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1635-1644.
  4. ^ Надь, К. А. 2005. Скорость метаболизма и размер тела. Журнал экспериментальной биологии 208(9):1621-1625.
  5. ^ Фрапелл, П. Б., Х. А. Блевин и Р. В. Бодинетт. 1989. Понимание респирометрических камер: что входит, должно выходить наружу. Журнал теоретической биологии 138(4):479-494. PMID  2593683
  6. ^ Уизерс, П. С. 2001. Проектирование, калибровка и расчет проточных респирометрических систем. Австралийский зоологический журнал49:445-461.
  7. ^ Лайтон, Дж. Р. Б. 2008. Измерение скорости метаболизма: руководство для ученых. Издательство Оксфордского университета. ISBN  0-19-531061-6.
  8. ^ Варфоломей, Г. А., Д. Флек и К. М. Флек. 1981. Мгновенные измерения потребления кислорода во время предполетной разминки и послеполетного охлаждения бабочек сфингид и сатурниид. Журнал экспериментальной биологии90(1):17-32.
  9. ^ Леви, А. 1964. Точность метода пузырькового измерителя для измерения расхода газа. Журнал научных инструментов 41 (7): 449-453.
  10. ^ Стивенс, Э. Д. 1992. Использование пластических материалов в системах измерения кислорода. Журнал прикладной физиологии 72: 801-804
  11. ^ а б c Гнайгер, Э. 2008. Полярографические датчики кислорода, оксиграф и респирометрия с высоким разрешением для оценки функции митохондрий. В: Дисфункция митохондрий при токсичности, вызванной лекарственными средствами (Дайкенс Дж. А. и Уилл Ю., ред.) Джон Вили: 327-352. ISBN  978-0-470-11131-4
  12. ^ Gnaiger E, ed (2007) «Митохондриальные пути и респираторный контроль». OROBOROS MiPNet Publications, Инсбрук, электронное 1-е издание, ISBN  978-3-9502399-0-4
  13. ^ Хильдебрандт, Т. и Grieshaber, M.K., 2008 Три ферментативные активности катализируют окисление сульфида до тиосульфата в митохондриях млекопитающих и беспозвоночных. FEBS J. (275): 3352-3361.
  14. ^ Нанн А. Фанг Н.А., Ричардс Дж. Г., Шульте. 2009 г. «Объясняют ли свойства митохондрий внутривидовые вариации термостойкости?». Журнал экспериментальной биологии 212:514-522.
  15. ^ Phielix E., Schrauwen-Hinderling VB, Mensink M., Lenaers E., Meex R., Hoeks J., Kooi ME, Moonen-Kornips E., Sels JP, Hesselink MK, Schrauwen P., 2008 Нижняя внутренняя АДФ-стимулированная митохондриальное дыхание лежит в основе in vivo митохондриальная дисфункция в мышцах больных сахарным диабетом 2 типа. Сахарный диабет 57(11): 2943-9.
  16. ^ Knauf C., Cani PD, Ait-Belgnaoui A., Benani A., Dray C., Cabou C., Colom A., Uldry M., Rastrelli S., Sabatier E., Godet N., Waget A., Pénicaud L., Valet P., Burcelin R., 2008. Передача сигналов глюкагоноподобного пептида 1 в головном мозге контролирует начало инсулинорезистентности, вызванной диетой с высоким содержанием жиров, и снижает расход энергии. Эндокринология 149: 4768-4777.
  17. ^ Hoeks J., Briedé JJ, de Vogel J., Schaart G., Nabben M., Moonen-Kornips E., Hesselink MK, Schrauwen P., 2008. Функция митохондрий, содержание и продукция ROS в скелетных мышцах крыс: эффект высокой -жирное кормление. FEBS Lett. 582: 510-516.
  18. ^ Увеличение митохондриального биогенеза, окислительного стресса и гликолиза в лимфомах мышей Энрике Сампера, Э., Моргадоб, Л., Эстрадаб, Дж. К., Бернадб, А., Хуббарда, А., Сусана Каденас, С., Мелова С., 2009. Увеличение в митохондриальном биогенезе, окислительном стрессе и гликолизе в лимфомах мышей. Свободный Радикальная биология и медицина 46(3): 387-396.
  19. ^ Хаттер Э., Унтерлугауэр Х., Гаредью А., Янсен-Дурр П. и Гнайгер Э. 2006 Респирометрия с высоким разрешением - современный инструмент в исследованиях старения. Exp. Геронтол. 41:103-109.

внешняя ссылка