Сортировка спермы - Sperm sorting

Сортировка спермы это средство выбора типа сперматозоид должен удобрять то яйцеклетка. Несколько традиционных техник центрифугирование или же приплывать. Новые применяемые методы, такие как проточная цитометрия, расширяют возможности сортировки сперматозоидов, и разрабатываются новые методы сортировки сперматозоидов.

Его можно использовать для сортировки наиболее здоровых сперматозоидов, а также для определения более конкретных признаков, таких как выбор пола в котором сперматозоиды разделены на ИКС- (женский) и Y- (мужские) популяции, несущие хромосомы, на основании различий в содержании ДНК. Полученные в результате сперматозоиды с «сортировкой по полу» можно использовать в сочетании с другими вспомогательными репродуктивными технологиями, такими как искусственное оплодотворение или же экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) для получения потомства желаемого пола - как у сельскохозяйственных животных, так и в медицинской практике человека.

Методы

Обычные методы

До появления проточной цитометрии для сортировки спермы использовалось несколько методов. Центрифугирование в градиенте плотности (с непрерывным или прерывистым градиентом) может концентрировать образцы спермы с низкой концентрацией сперматозоидов, используя плотность спермы в качестве меры их качества.[1][2] Точно так называемые приплывать В методиках применяется стадия центрифугирования, после чего сперматозоидам позволяют плавать в среде, обогащая таким образом субпопуляцию подвижных сперматозоидов. Однако центрифугирование сперматозоидов отрицательно сказывается на жизнеспособности сперматозоидов и вызывает выработку активных форм кислорода.[1] Обычные методы обычно используются в вспомогательных репродуктивных технологиях.[3]

Проточной цитометрии

Проточной цитометрии - еще один метод, используемый для сортировки сперматозоидов, и его адаптации открывают новые возможности в сортировке сперматозоидов. Однако, поскольку при сортировке сперматозоидов на основе проточной цитометрии часто используются флуоресцентные красители, которые часто окрашивают ДНК, безопасность этого метода в репродуктивной медицине человека является предметом научных дискуссий.[4][5]

Однако проточная цитометрия - единственный используемый в настоящее время метод, способный определить пол будущего потомства путем измерения содержания ДНК в отдельных сперматозоидах. Он оценивает, содержат ли они большее Х хромосома (давая потомство женского пола) или меньше Y-хромосома (приводящие к потомству мужского пола). Затем он позволяет разделить сперматозоиды X и Y.[6] Так называемой Технология определения пола спермы Beltsfield был разработан Министерством сельского хозяйства США совместно с Ливерморской национальной лабораторией Лоуренса, основываясь на различии ДНК между X- и Y-хромосомами.[7] Перед проведением проточной цитометрической сортировки сперму маркируют флуоресцентным красителем, который называется Hoechst 33342 который связывается с ДНК каждого сперматозоида. Поскольку X-хромосома больше (т.е. содержит больше ДНК), чем Y-хромосома, «женские» (несущие X-хромосому) сперматозоиды будут поглощать большее количество красителя, чем их мужской (несущий Y-хромосому) аналог. Как следствие, при воздействии ультрафиолетового света во время проточной цитометрии X-сперматозоиды флуоресцируют ярче, чем Y-сперматозоиды. Когда сперматозоиды проходят через проточный цитометр в виде одного файла, каждый сперматозоид заключен в одну каплю жидкости, и ему присваивается электрический заряд, соответствующий его хромосомному статусу (например, X-положительный заряд, Y-отрицательный заряд). Затем поток капель X и Y разделяется с помощью электростатического отклонения и собирается в отдельные пробирки для сбора для последующей обработки.[8]

Другой цитометрический метод, используемый при сортировке сперматозоидов, - это магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), который обычно применяется в больницах вспомогательной репродукции для сортировки сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Это достигается с помощью антитела к поверхностным маркерам запрограммированной гибели клеток (апоптоз ) Такие как аннексин V, в сочетании с магнитными бусинами. После связывания этих антител сперматозоиды, подвергшиеся апоптозу, сортируются путем применения магнитное поле к суспензии спермы.[9] MACS устраняет необходимость во флуоресцентных ДНК-связывающих молекулах.

Другие техники

Повреждение ДНК в сперматозоидах можно обнаружить с помощью Рамановская спектроскопия.[10] Однако он недостаточно специфичен для выявления индивидуальных черт.[10] Сперматозоиды с наименьшим повреждением ДНК могут быть впоследствии введены в яйцеклетку путем инъекции. интрацитоплазматическая инъекция спермы (ИКСИ).[10] Многие другие методы сортировки спермы были предложены или в настоящее время проходят испытания.[1][3]

Для отбора сперматозоидов с низким Повреждение ДНК index популяция сперматозоидов может быть обогащена сперматозоидами с нефрагментированной ДНК с помощью таких методов, как электрофорез[11], Z метод[12] и MACS (магнитно-активирующая сортировка клеток), которая в сочетании с центрифугированием в градиенте плотности в протоколах подготовки отдельных сперматозоидов приводит к сперматозоидам высшего качества.[13].

Сайты связывания гиалуроновой кислоты (НА) на плазматической мембране сперматозоидов являются индикатором зрелости сперматозоидов (Huszar et al., 2003, Yudin et al., 1999). Есть два метода, основанных на этом факте: физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (PICSI) и медленная процедура спермы; оба метода требуют подготовки спермы путем промывки или центрифугирования спермы.

Приложения

Сперма подвергается процессу естественный отбор когда миллионы сперматозоидов попадают во влагалище, но лишь немногие достигают яйцеклетки, и тогда только одному обычно позволяют удобрять Это. Сперма отбирается не только по высшей подвижность но также и другими факторами, такими как Целостность ДНК, изготовление активные формы кислорода и жизнеспособность. Этот выбор в значительной степени обходится в случае экстракорпоральное оплодотворение что приводит к более высокой заболеваемости врожденные дефекты связана с вспомогательные репродуктивные техники. Яйцеклетки часто оплодотворяются спермой, у которой мало шансов оплодотворить ее в естественных условиях.[1] Таким образом, сортировку спермы можно использовать для снижения рисков, связанных с вспомогательной репродукцией. Кроме того, продолжаются дискуссии об использовании сортировки спермы для выбора пола ребенка.

Для общего здоровья

Обычные методы сортировки сперматозоидов широко используются для оценки качества спермы перед последующим искусственное оплодотворение или же экстракорпоральное оплодотворение. Было подтверждено, что сперма, отсортированная с использованием этих методов, имеет более высокое качество, чем несортированная.[14][15] Однако важные характеристики сперматозоидов, такие как целостность ДНК, остаются непроверенными с помощью этих традиционных методов. Новые методы проточной цитометрии, такие как ЙО-ПРО окрашивание может отличить апоптотический и мертвые сперматозоиды из жизнеспособных.[2] Например, аннексин V окрашивание с последующим MACS может значительно улучшить частоту наступления беременности в парах, у которых в прошлом отсутствовала вспомогательная репродукция.[9]

Для выбора пола

В сельском хозяйстве

Сортировка спермы с помощью проточной цитометрии является признанным методом в ветеринарной практике, и в молочной промышленности большинство коров подвергаются искусственному осеменению отсортированной спермой для увеличения количества маток. телята (использование сортировки сперматозоидов реже у других видов сельскохозяйственных животных, однако распространено искусственное оплодотворение).[16] Искусственное оплодотворение сельскохозяйственных животных отсортированной спермой признано Продовольственная и сельскохозяйственная организация (ФАО) как многообещающий способ повышения эффективности сельского хозяйства, необходимого для производства достаточного количества пищи для растущего населения. Использование искусственного оплодотворения рассортированной спермой рассматривается как способ создать оптимальное соотношение телят мужского и женского пола для увеличения молочной продуктивности. производство молока.[16]

В людях

Дальнейшая информация: Выбор пола § Этические соображения

Выбор пола детей может помочь предотвратить наследственные заболевания, связанные с полом Такие как Мышечная дистрофия Дюшена или же гемофилия в семьях с историей этих заболеваний. С другой стороны, сортировка сперматозоидов у людей поднимает этические проблемы, связанные с идеей выбор пола. При крупномасштабном применении он может вызвать дисбаланс соотношения полов. Это также может иметь последствия для гендерного равенства, если родители постоянно выбирают мальчика в качестве своего первенца (было доказано, что первенцы имеют больше шансов на успех в жизни).[17]

В период с начала до середины 1980-х гг. Гленн Сполдинг был первым, кто отсортировал жизнеспособные цельные сперматозоиды человека и животных с помощью проточного цитометра и использовал отсортированную подвижную сперму кролика для искусственного осеменения. Впоследствии первая заявка на патент, раскрывающая метод сортировки «двух жизнеспособных субпопуляций, обогащенных x- или y-сперматозоидами», была подана в апреле 1987 г. под серийным номером заявки США 35 986 и позже стала частью патента США 5 021 244; и патент включал открытие гаплоидный экспрессия (ассоциированные с полом мембранные белки или белки SAM) и выработка моноклональных антител к этим белкам.[18] Были добавлены дополнительные приложения и методы, включая антитела, с 1987 по 1997 год.[19] На момент подачи заявки на патент оба Национальные лаборатории Лоуренса Ливермора и USDA сортировали только фиксированные ядра сперматозоидов,[20] после подачи заявки на патент с серийным номером 35 986 Министерством сельского хозяйства США была использована новая методика, при которой «сперму на короткое время обрабатывали ультразвуком для удаления хвостов».[21]

В мире нет страны, которая прямо разрешает выбор пола в немедицинских целях. В 2009 году 31 страна разрешила выбор пола в случае риска заболеваний, связанных с полом, или в других медицинских целях.[22] В США для людей применение сортировки сперматозоидов при выборе пола строго регулируется FDA. После создания техники MicroSort она была предложена родителям в рамках клиническое испытание. Процедура была доступна ограниченному количеству участников каждый месяц, в дополнение к выполнению определенных критериев, таких как наличие заболевания с секс-связь или иметь хотя бы одного ребенка (для баланса семьи).[23] В настоящее время лаборатории MicroSort и врачи, сотрудничающие с ними, существуют в нескольких странах (некоторые для общих целей, некоторые предлагают услуги только в случае риска генетических заболеваний, связанных с одним полом).[24]

При высокой точности сортировка сперматозоидов с помощью проточной цитометрии не позволяет получить две совершенно разные популяции. То есть всегда будет какая-то «мужская» сперма среди «женской» спермы, и наоборот. Точный процент чистоты каждой популяции зависит от сортируемых видов и «ворот», которые оператор размещает вокруг всей популяции, видимой для машины. В целом, чем больше разница в ДНК между X- и Y-хромосомами вида, тем легче создать высокочистую популяцию. У овец и крупного рогатого скота чистота для каждого пола обычно остается выше 90% в зависимости от «стробирования», в то время как для людей она может снижаться до 90% и 70% для «женских» и «мужских» сперматозоидов соответственно.[23]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c d Rappa, Kari L .; Родригес, Гарольд Ф .; Hakkarainen, Gloria C .; Анчан, Раймонд М .; Mutter, Джордж Л .; Асгар, Васим (01.09.2016). «Обработка спермы для передовых репродуктивных технологий: где мы сегодня?». Достижения биотехнологии. 34 (5): 578–587. Дои:10.1016 / j.biotechadv.2016.01.007. PMID  26845061.
  2. ^ а б Рибейро, София С .; Сарториус, Гедеон; Плетчер, Флурина; Гейтер, Мария де; Чжан, Хун; Гейтер, Кристиан де (сентябрь 2013 г.). «Выделение сперматозоидов с низким уровнем фрагментированной ДНК с использованием проточной цитометрии и сортировки». Фертильность и бесплодие. 100 (3): 686–694.e4. Дои:10.1016 / j.fertnstert.2013.05.030. PMID  23809499.
  3. ^ а б Пааш, Уве; Грюневальд, Соня; Гландер, Ханс-Юрген (01.01.2007). «Отбор спермы при вспомогательных репродуктивных технологиях». Дополнение Общества репродукции и фертильности. 65: 515–525. ISSN  1747-3403. PMID  17644989.
  4. ^ Кароппо, Этторе (сентябрь 2013 г.). «Сортировка спермы для отбора здоровой спермы: это безопасно и полезно?». Фертильность и бесплодие. 100 (3): 695–696. Дои:10.1016 / j.fertnstert.2013.06.006. PMID  23809504.
  5. ^ Рибейро, София; Сарториус, Гедеон; Гейтер, Кристиан де (сентябрь 2013 г.). «Сортировка сперматозоидов с помощью проточной цитометрии». Фертильность и бесплодие. 100 (3): e15. Дои:10.1016 / j.fertnstert.2013.06.039. PMID  23876533.
  6. ^ Johnson, L.A .; Welch, G.R .; Ренс, W. (1999-01-01). «Технология определения пола сперматозоидов Beltsville: высокоскоростная сортировка сперматозоидов дает улучшенный выход спермы для экстракорпорального оплодотворения и искусственного интеллекта». Журнал зоотехники. 77 Дополнение 2: 213–220. Дои:10.2527 / 1999.77suppl_2213x. ISSN  0021-8812. PMID  15526798.
  7. ^ Гарнер Д.Л., Зайдель Г.Е. История коммерциализации спермы для крупного рогатого скота. Териогенология 2008; 69: 886-895.
  8. ^ Зайдель Г.Е., младший, Гарнер Д.Л. Текущее состояние определения пола сперматозоидов млекопитающих. Репродукция 2002; 124: 733-743.
  9. ^ а б Гил, Моника; Сар-Шалом, Валери; Сивира, Йолисид Мелендес; Каррерас, Рамон; Чека, Мигель Анхель (2013-03-07). «Отбор спермы с использованием сортировки по магнитно-активированным клеткам (MACS) при вспомогательной репродукции: систематический обзор и метаанализ». Журнал вспомогательной репродукции и генетики. 30 (4): 479–485. Дои:10.1007 / s10815-013-9962-8. ISSN  1058-0468. ЧВК  3644127. PMID  23468098.
  10. ^ а б c Ранжирование сперматозоидов может улучшить шансы на оплодотворение in vitro. Кортни Хамфрис. Обзор технологий. 21 января 2009 г., Среда
  11. ^ Fleming, S.D .; Ilad, R.S .; Griffin, A-M.G .; Wu, Y .; Онг, К.Дж .; Smith, H.C .; Эйткен, Р.Дж. (2008-09-01). «Проспективное контролируемое испытание электрофоретического метода подготовки спермы для вспомогательной репродукции: сравнение с центрифугированием в градиенте плотности». Репродукция человека. 23 (12): 2646–2651. Дои:10.1093 / humrep / den330. ISSN  0268-1161. PMID  18765400.
  12. ^ Kheirollahi-Kouhestani, M .; Разави, С .; Tavalaee, M .; Deemeh, M.R .; Mardani, M .; Moshtaghian, J .; Наср-Исфахани, M.H. (2009-10-01). «Отбор спермы на основе комбинированного градиента плотности и метода Зета может улучшить результат ИКСИ». Репродукция человека. 24 (10): 2409–2416. Дои:10.1093 / humrep / dep088. ISSN  0268-1161. PMID  19553239.
  13. ^ Сказал, Укротитель; Агарвал, Ашок; Грюневальд, Соня; Раш, Манья; Бауманн, Томас; Кригель, Кристиан; Ли, Лян; Гландер, Ханс-Юрген; Томас, Энтони Дж .; Пааш, Уве (2006-03-01). «Выбор неапоптотических сперматозоидов в качестве нового инструмента для улучшения результатов вспомогательной репродукции: модель in vitro1». Биология размножения. 74 (3): 530–537. Дои:10.1095 / биолрепрод.105.046607. ISSN  0006-3363. PMID  16306419.
  14. ^ Эйткен, Р. Джон; Кларксон, Джейн С. (1988-11-12). «Значение активных форм кислорода и антиоксидантов в определении эффективности методов подготовки спермы». Журнал Андрологии. 9 (6): 367–376. Дои:10.1002 / j.1939-4640.1988.tb01067.x. ISSN  1939-4640. PMID  3215823.
  15. ^ De Geyter, C .; Bals-Pratsch, M .; Doeren, M .; Yeung, C.H .; Grunert, J. H .; Bordt, J .; Schneider, H.P .; Нишлаг, Э. (1988-11-01). «Проникновение цервикальной слизи у человека и крупного рогатого скота как тест функции спермы для экстракорпорального оплодотворения». Репродукция человека (Оксфорд, Англия). 3 (8): 948–954. Дои:10.1093 / oxfordjournals.humrep.a136824. ISSN  0268-1161. PMID  3204150.
  16. ^ а б Rath, D .; Barcikowski, S .; de Graaf, S .; Garrels, W .; Grossfeld, R .; Klein, S .; Knabe, W .; Knorr, C .; Кус, В. (01.01.2013). «Половой отбор спермы у сельскохозяйственных животных: отчет о состоянии и перспективы развития». Репродукция (Кембридж, Англия). 145 (1): R15–30. Дои:10.1530 / REP-12-0151. ISSN  1741-7899. PMID  23148085.
  17. ^ Kalfoglou, A.L .; Kammersell, M .; Philpott, S .; Даль, Э. (март 2013 г.). «Этические аргументы за и против сортировки спермы для немедицинского выбора пола: обзор». Репродуктивная биомедицина онлайн. 26 (3): 231–239. Дои:10.1016 / j.rbmo.2012.11.007. PMID  23337421.
  18. ^ Патент США 5021244, столбец 9, Сортировка спермы; http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PALL&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsrchnum.htm&r=1&f=G&l=50&s1=5021244&PN.50 = PN / 5021244
  19. ^ Патент США 5,021,244; 5,346,990; 5,369,012; 5 439 362; 5,496,722; 5648468; 5,660,997; PCT / US1989 / 002069
  20. ^ Л. А. Джонсон, Дж. П. Флок, М. В. Лук, Д. Пинкел, Поточная сортировка сперматозоидов, несущих X и Y хромосомы, на две популяции. Gamete Research, том 16, выпуск 1, страницы 1–9, январь 1987 г .; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mrd.1120160102/abstract
  21. ^ Л. А. Джонсон, Дж. П. Флок и М. В. Лук, Проточная цитометрия сперматозоидов, несущих X- и Y-хромосомы, для определения ДНК с использованием улучшенного метода подготовки и окрашивания Hoechst 33342. Gamete Research Volume 17, Issue 3, July 1987, Pages: 203–212; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mrd.1120170303/abstract
  22. ^ Дарновский, Марси (2009). «Страны, в которых действуют законы или политика в отношении выбора пола» (PDF). geneticsandsociety.org. Получено 2016-10-06.
  23. ^ а б Институт генетики и ЭКО: клинические испытания MicroSort
  24. ^ ThemeFuse. «О нас | MicroSort International». www.microsort.com. Получено 2016-10-06.