Транспозоны как генетический инструмент - Transposons as a genetic tool

Транспозоны полу-паразитический ДНК последовательности, которые могут реплицироваться и распространяться через геном. Их можно использовать как генетический инструмент для анализа ген и белок функция. Использование транспозонов хорошо развито в Дрозофила (в котором P элементы наиболее часто используются) и в кресс-салате Thale (Arabidopsis thaliana ) и бактерии, такие как кишечная палочка (Кишечная палочка ).^[1][2]

В настоящее время транспозоны может использоваться в генетических исследованиях и рекомбинантных генная инженерия за инсерционный мутагенез. Инсерционный мутагенез - это когда транспозоны функционируют как векторов чтобы помочь удалить и интегрировать генетические последовательности. Учитывая их относительно простую конструкцию и присущую им способность перемещать последовательности ДНК, транспозоны хорошо совместимы при трансдукции генетического материала, что делает их идеальными генетическими инструментами.

Мутагенез с подписью

Сигнатурный мутагенез (также известный как STM) - это метод, ориентированный на использование вставки мобильного элемента для определения фенотипа локуса в геноме организма. Хотя методы генетического секвенирования могут определять генотип генома, они не могут определять функцию или фенотипическую экспрессию последовательностей генов.^[3][4] STM может обойти эту проблему, мутируя локус, заставляя его формировать новый фенотип; сравнивая наблюдаемые фенотипические выражения мутированного и неизмененного локуса, можно вывести фенотипическое выражение локуса.

В STM специально помеченные транспозоны вставляются в организм, такой как бактерия, и случайным образом интегрируются в геном хозяина. Теоретически модифицированный мутантный организм должен экспрессировать измененный ген, изменяя таким образом фенотип. Если наблюдается новый фенотип, геном секвенируется и ищется помеченные транспозоны.^[3] Если сайт интеграции транспозона обнаружен, то локус может нести ответственность за экспрессию фенотипов.^[5][6]

Было проведено множество исследований СТМ на основе транспозонов, в первую очередь с P элементы^[4] в Дрозофила. P элементы транспозоны, первоначально описанные в Drosophila melanogaster геном может быть искусственно синтезирован или распространен на другие Дрозофила виды путем горизонтального переноса.^[4] В экспериментальных испытаниях искусственно созданные элементы P и гены транспозаз вставляются в геномы Дрозофила эмбрионы. Впоследствии геномы эмбрионов с мутациями секвенируются и сравниваются, что позволяет выявить локусы, на которые повлияла вставка, и роли локусов.^[4][6]

Инсерционная инактивация

Инсерционная инактивация фокусируется на подавлении экспрессии гена путем нарушения его последовательности вставкой. Когда дополнительные нуклеотиды вставляются рядом с локусом или в него, локус может пострадать от мутация сдвига рамки это может помешать его правильному выражению в полипептидная цепь. Инсерционная инактивация на основе транспозонов рассматривается для медицинских исследований по подавлению устойчивость к антибиотикам в бактериях для лечения генетические заболевания.^[7] При лечении генетических заболеваний вставка транспозона в локус вредного гена генома организма приведет к смещению последовательности локуса, усекая любые образованные вредные белки и делая их нефункциональными. В качестве альтернативы инсерционная инактивация может использоваться для подавления генов, которые выражают устойчивость бактерий к антибиотикам.,^[7][8]

Спящая красавица

Хотя транспозоны успешно использовались у растений и беспозвоночных посредством инсерционного мутагенеза и инсерционной активации, использование транспозонов у позвоночных было ограничено из-за отсутствия транспозонов, специфичных для позвоночных. Почти все транспозоны, совместимые с геномами позвоночных и присутствующие в них, неактивны и часто относят к «мусорной» ДНК.^[6] Однако можно идентифицировать неактивные транспозоны и искусственно воссоздавать их в качестве активных агентов.^[6] Исследователи-генетики Жужанна Извак и Золтан Ивичс обнаружили последовательность транспозона рыбы, которая, несмотря на то, что она бездействовала в течение 15 миллионов лет, могла быть воскрешена в качестве вектора для введения чужеродных генов в геномы позвоночных, включая человеческие. Этот транспозон, получивший название "Спящая красавица", был описан в 1997 году и мог быть искусственно реактивирован в функционирующий транспозон.^[6]

«Спящая красавица» также может применяться в процедурах генной терапии, помогая внедрять полезные трансгены в геномы хозяина. Belcher et al. проверили это понятие, используя транспозоны «Спящей красавицы», чтобы помочь ввести последовательности мышам с серповидно-клеточной анемией, чтобы они могли производить ферменты, необходимые для противодействия их анемии.^[6] Belcher et al. начали свой эксперимент с создания генетической последовательности, состоящей из мобильного элемента Hmox-1 и транспозазы из "Спящей красавицы". Затем эту последовательность добавляли, вставляли в плазмиду и вводили в клетки мышей. Транспозаза от Sleeping Beauty помогла вставить транспозон Hmox-1 в геном мышей, что позволило производить фермент гемоксигеназу-1 (HO-1). Мыши, которым вводили вставку, показали пятикратное увеличение экспрессии HO-1, что, в свою очередь, уменьшило закупорку кровеносных сосудов из-за серповидноклеточной анемии. Публикация эксперимента в 2010 году показала, что транспозоны могут быть полезны в генной терапии.^[6]

P Элементы как инструмент (Дрозофила)

Встречающиеся в природе P элементы содержать:

• кодирующая последовательность для фермента транспозаза;
• последовательности распознавания для действия транспозазы.

Транспозаза - это фермент, который регулирует и катализирует удаление Р-элемента из ДНК-хозяина, разрезая два сайта узнавания, а затем повторно вставляет Р-элемент случайным образом. Это процесс случайной вставки, который может мешать существующим генам или нести дополнительный ген, который может использоваться в качестве процесса для генетических исследований.

Чтобы использовать этот процесс как полезный и управляемый генетический инструмент, две части элемента P должны быть разделены, чтобы предотвратить неконтролируемое перемещение. Таким образом, нормальные генетические инструменты:

• ДНК, кодирующая транспозазу (или иногда просто транспозазу) без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться; и
• а «П плазмид».

Плазмиды P всегда содержат:

• а Дрозофила репортерный ген, часто маркер красных глаз (продукт белый ген);
• последовательности распознавания транспозаз;

и может содержать:

• интересующий ген;
• ан Кишечная палочка репортерный ген (часто антибиотик сопротивление); и
• начало репликации и другие связанные плазмида последовательность «домашнего хозяйства».

Способы использования (Дрозофила)

(Методы прямой генетики) Существует два основных способа использования этих инструментов: трансформация мух и инсерционный мутагенез, каждый из которых описан ниже.

Трансформация мухи

(в надежде на вставку в некодирующие области)

1. Microinject задний конец ранней стадии (пре-клеточность) эмбрион с кодированием для транспозаза и плазмида с репортерным геном, представляющим интерес геном и последовательностями распознавания транспозазы.
2. Происходит случайная транспозиция, вставляя интересующий ген и репортерный ген.
3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. При селекции передается только генотип гамет, устраняя эту вариацию).
4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут вставленный интересующий ген, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за интересующего гена.

Важно отметить, что вставленный ген мог нарушить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

Вставной мутагенез

(в надежде на вставку в кодовую область)

1. Микроинъекция эмбриона с кодированием транспозазы и плазмида с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (и часто Кишечная палочка репортерный ген и начало репликации и т. д.).
2. Происходит случайная транспозиция, случайным образом вставляя репортерный ген. Встраивание обычно происходит рядом с активно транскрибируемыми генами, поскольку именно здесь хроматин структура самая рыхлая, поэтому ДНК наиболее доступна.
3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма (см. Выше).
4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они прошли успешную транспозицию, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа, обусловленного мутация существующих генов.

Возможные мутации:

1. Вставка в транслируемую область => гибридный белок / усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются более сложные эффекты.
2. Вставка в интрон => переделана сращивание сбой шаблона / сращивания. Обычно приводит к усечению белка или образованию неактивных неправильно сплайсированных продуктов, хотя обычно наблюдаются более сложные эффекты.
3. Вставка в 5 '(последовательность, которая станет 5' UTR мРНК) нетранслируемой области => усечение транскрипта. Обычно приводит к тому, что мРНК не содержит Крышка 5 футов, что снижает эффективность перевода.
4. Вставка в промотор => уменьшение / полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня производства протеина. Самый полезный вид прошивки для анализа из-за простоты ситуации.
5. Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами => потеря функции энхансера / захват функции энхансера для репортерного гена. † Как правило, снижает уровень специфичности белка к типу клетки, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.

† Захват усилителя

Захват энхансера из другого гена позволяет анализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, может использоваться для картирования экспрессии мутированного гена в организме и является очень мощным инструментом.

Другое использование элементов P (Дрозофила)

(Метод обратной генетики)

Вторичная мобилизация

Если рядом с интересующим геном есть старый элемент P (со сломанной транспозазой), вы можете повторно мобилизовать эмбрион с помощью микроинъекции с кодированием транспозазы или самой транспозазы. Элемент P часто перемещается в пределах нескольких килобаз от исходного местоположения, надеясь, что это повлияет на интересующий вас ген, как на «Insertional Mutagenisis».

Анализ продуктов мутагенеза (Дрозофила)

После определения функции мутированного белка можно секвенировать / очистить / клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

Обратная ПЦР

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, с помощью ПЦР.

Основная статья: Обратная ПЦР

1. Изолируйте геном мухи.
2. Пройдите легкий переваривание (используя фермент [фермент 1], который, как известно, НЕ разрезает репортерный ген), с получением фрагментов в несколько килобаз, некоторые из которых содержат вставку и ее фланкирующую ДНК.
3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат вставку и ее фланкирующую ДНК.
4. Разрежьте плазмиды в какой-то момент репортерного гена (с помощью фермента [фермента 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но известен как репортерный ген).
5. Используя праймеры для секций репортерного гена, ДНК можно амплифицировать для последовательность действий.

Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив участок разреза [фермента 1].

Плазмидное спасение (Кишечная палочка Трансформация)

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, путем спасения плазмиды.

1. Изолируйте геном мухи.
2. Пройдите легкий переваривание (используя фермент [фермент 1], который, как известно, разрезает границу между репортерным геном и Кишечная палочка репортерного гена и плазмидных последовательностей), давая фрагменты в несколько килобаз, некоторые из которых Кишечная палочка репортер, последовательности плазмиды и ее фланкирующая ДНК.
3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых имеют Кишечная палочка репортер, последовательности плазмиды и ее фланкирующая ДНК.
4. Вставьте плазмиды в клетки E. coli (например, электропорацией).
5. Скрининг плазмид на репортерный ген E. coli. Только успешные вставки плазмид с последовательностями «домашнего хозяйства» плазмиды будут экспрессировать этот ген.

7. Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

Применение переносного элемента Другие организмы

Геномы других организмов можно анализировать аналогичным образом, хотя и с другими мобильными элементами. Недавнее открытие 'транспозон моряка '(реконструкция исходной последовательности из многих «мертвых» версий в геноме человека) позволила провести множество новых экспериментов, у моряка есть хорошо законсервированные гомологи для широкого круга видов, и он является очень универсальным инструментом.

Рекомендации

В этой статье использованы материалы из Citizendium статья "Транспозоны как генетический инструмент "под лицензией Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Непортированная лицензия но не под GFDL.

1. Beckwith, J .; Силхави, Т. (1992). Сила бактериальной генетики: курс на основе литературы. Нью-Йорк: Лаборатория издательства Колд-Спринг-Харбор. С. 555–614. ISBN  0-87969-411-4.
2. Клекнер Н., Рот Дж., Ботштейн Д. (октябрь 1977 г.). «Генная инженерия in vivo с использованием перемещаемых элементов лекарственной устойчивости. Новые методы в бактериальной генетике». J. Mol. Биол. 116 (1): 125–59. Дои:10.1016/0022-2836(77)90123-1. PMID  338917.
3. Берг, Клэр; Берг, Дуглас Э. «Инструменты сменных элементов для микробной генетики». EcoSal.
4. Энгельс, Уильям Р. "P элементы в дрозофиле". Департамент генетики Университета Висконсина. Архивировано из оригинал на 2006-01-11.
5. Ивиц З., Ли М.А., Матес Л. и др. (Июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованная манипуляция геномом у позвоночных». Nat. Методы. 6 (6): 415–22. Дои:10.1038 / nmeth.1332. ЧВК  2867038. PMID  19478801.
6. Люфт ФК (июль 2010 г.). «Спящая красавица поднимается на новые высоты». J. Mol. Med. 88 (7): 641–3. Дои:10.1007 / s00109-010-0626-1. PMID  20467721.
7. Бергер-Бачи B (апрель 1983 г.). «Инсерционная инактивация устойчивости стафилококка к метициллину с помощью Tn551». J. Bacteriol. 154 (1): 479–87. ЧВК  217482. PMID  6300037.
8. Золтана Ивиц; Мэн Эми Ли; Лайош Матес; Джеф Д. Боке; Аллан Брэдли (июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованные манипуляции геномом у позвоночных». Nat. Методы. 6 (6): 415–22. Дои:10.1038 / nmeth.1332. ЧВК  2867038. PMID  19478801.

дальнейшее чтение

• Снайдер, Л .; Чампнесс, W. (2003). «Глава 9: Транспозиция и сайт-специфическая рекомбинация». Молекулярная генетика бактерий (2-е изд.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press. стр.303–340. ISBN  1-55581-204-X.
• «Библиография: транспозоны как генетический инструмент». Citizendium.org.
• Видеть Martienssen, R.A .; Спрингер, П.С. "Энхансер и мутагенез транспозона генной ловушки у Arabidopsis". Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.