Фрагментация (клеточная биология) - Fragmentation (cell biology)

Для использования в других целях см. Фрагментация (значения).

В клеточная биология, способы, которыми фрагментация полезно для клетки: клонирование ДНК и апоптоз. Клонирование ДНК важно в бесполое размножение или создание идентичных молекул ДНК, и может выполняться клеткой спонтанно или намеренно лабораторными исследователями. Апоптоз - это запрограммированное разрушение клеток и молекул ДНК внутри них, и это строго регулируемый процесс. Эти два способа использования фрагментации в клеточных процессах описывают нормальные клеточные функции и общие лабораторные процедуры, выполняемые с клетками. Однако проблемы внутри клетки иногда могут вызывать фрагментацию, которая приводит к нарушениям, таким как фрагментация эритроцитов и фрагментация ДНК сперматозоидов.

Клонирование ДНК

Клонирование ДНК может выполняться клеткой спонтанно в репродуктивных целях. Это форма бесполого размножения, когда организм распадается на фрагменты, а затем каждый из этих фрагментов развивается в зрелых, полностью выросших особей, которые являются клонами исходного организма (см. репродуктивная фрагментация Клонирование ДНК также может быть выполнено намеренно лабораторными исследователями. Здесь фрагментация ДНК - это молекулярно-генетический метод, который позволяет исследователям использовать рекомбинантная ДНК технология для подготовки большого количества идентичных молекул ДНК. для завершения клонирования ДНК необходимо получить дискретные небольшие участки ДНК организма, которые составляют определенные гены. Только относительно небольшие молекулы ДНК можно клонировать в любые доступные вектор. Следовательно, длинные молекулы ДНК, составляющие геном организма, должны быть расщеплены на фрагменты, которые можно вставить в векторную ДНК.[1] Два фермента способствуют производству таких рекомбинантных молекул ДНК:

1. Рестрикционные ферменты
Ферменты рестрикции эндонуклеазы продуцируются бактериями, которые обычно распознают небольшие последовательности пар оснований (называемые сайты ограничения ), а затем расщепить обе нити ДНК на этом сайте.[2] Сайт рестрикции обычно палиндромная последовательность, что означает, что последовательность сайтов рестрикции одинакова на каждой цепи ДНК при чтении в направлении от 5 'к 3'.
Для каждого рестрикционного фермента бактерии также производят модифицирующий фермент, чтобы собственная ДНК бактерии-хозяина была защищена от расщепления. Это делается путем модификации ДНК хозяина на каждом потенциальном сайте расщепления или рядом с ним. Фермент модификации добавляет метильная группа к одному или двум основаниям, и присутствие этой метильной группы предотвращает разрезание ДНК эндонуклеазой рестрикции.[3]
А
Обрез, который создает липкий конец
А
Обрез, создающий тупой конец
Многие рестрикционные ферменты делают ступенчатые разрезы в двух цепях ДНК на их сайте узнавания, что приводит к образованию фрагментов с однонитевым «хвостом», выступающим с обоих концов, называемым липким концом. Ферменты рестрикции также могут делать прямые разрезы в двух цепях ДНК в их сайте узнавания, что приводит к тупым концам.[4]
2. ДНК-лигаза
Во время нормальной репликации ДНК ДНК-лигаза катализирует сквозное соединение (лигирование) коротких фрагментов ДНК, называемых Фрагменты Окадзаки. В целях клонирования ДНК очищенная ДНК-лигаза используется для ковалентного соединения концов рестрикционного фрагмента и векторной ДНК, которые имеют комплементарные концы. Они ковалентно лигированы вместе через стандартные 3 '- 5' фосфодиэфирные связи ДНК.[5]
ДНК-лигаза может лигировать комплементарный липкие и тупые концы, но лигирование тупых концов неэффективно и требует более высокой концентрации как ДНК, так и ДНК-лигазы, чем лигирование липких концов.[6] По этой причине большинство рестрикционных ферментов, используемых при клонировании ДНК, делают разрезы в цепях ДНК в шахматном порядке, создавая липкие концы.

Ключом к клонированию фрагмента ДНК является его соединение с молекулой векторной ДНК, которая может реплицироваться в клетке-хозяине. После того, как единственная рекомбинантная молекула ДНК (состоящая из вектора плюс вставленный фрагмент ДНК) введена в клетку-хозяин, вставленная ДНК может реплицироваться вместе с вектором, создавая большое количество идентичных молекул ДНК.[7]Базовую схему для этого можно резюмировать следующим образом:

Вектор + фрагмент ДНК
↓
Рекомбинантная ДНК
↓
Репликация рекомбинантной ДНК внутри клетки-хозяина
↓
Выделение, секвенирование и манипуляции с очищенным фрагментом ДНК

Есть множество экспериментальных вариаций этой схемы, но эти шаги необходимы для клонирования ДНК в лаборатории.[8]

Апоптоз

Фрагментация - это третий и последний этап разборки клеток во время апоптоза (правая часть схемы).[9]

Апоптоз относится к гибели клеток определенной формой запрограммированная гибель клеток, характеризующийся четко выраженной последовательностью морфологических изменений.[10] Сжатие клеток и ядер, конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптотических телец и фагоцитоз по соседним клеткам характеризуют основные морфологические изменения в процессе апоптоза.[11] Обширные морфологические и биохимические изменения во время апоптоза гарантируют, что умирающие клетки оказывают минимальное воздействие на соседние клетки и / или ткани.

Гены, участвующие в контроле гибели клеток, кодируют белки с тремя различными функциями:[12]

  • Белки-убийцы необходимы клетке, чтобы начать процесс апоптоза.
  • Белки "разрушения" выполняют такие функции, как переваривание ДНК в умирающей клетке.
  • Белки "поглощения" необходимы для фагоцитоза умирающей клетки другой клеткой.

Расщепление хромосомной ДНК на более мелкие фрагменты является неотъемлемой частью и биохимическим признаком апоптоза. Апоптоз включает активацию эндонуклеаз с последующим расщеплением ДНК хроматина на фрагменты из 180 пар оснований или кратные 180 парам оснований (например, 360, 540). Этот образец фрагментации может использоваться для обнаружения апоптоза в таких тестах, как Лестница ДНК проба с гель-электрофорез, а TUNEL анализ, или Николетти пробирный.[13]Апоптотическая фрагментация ДНК зависит от фермента, называемого Каспазо-активируемая ДНКаза (CAD).[14] CAD обычно подавляется другим белком в клетке, называемым Ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы (ICAD).[15] Для того чтобы начался апоптоз, фермент под названием каспаза 3 расщепляет ICAD, так что CAD становится активным. CAD затем расщепляет ДНК между нуклеосомы, которые встречаются в хроматине с интервалами 180 пар оснований. Сайты между нуклеосомами - единственные части ДНК, которые открыты и доступны для CAD.[16]

Неровности

Фрагментация ДНК может происходить при определенных условиях в нескольких различных типах клеток. Это может привести к проблемам для клетки или к тому, что клетка получит сигнал о прохождении апоптоза. Ниже приведены несколько примеров нерегулярной фрагментации, которая может происходить в клетках.

1. Фрагментация красных кровяных телец.
А
Мазок крови пациента с гемолитической анемией, показывающий шистоциты
Фрагментированный эритроцит известен как шистоцит и обычно является результатом внутриклеточного механического повреждения эритроцита.[17] Может наблюдаться большое разнообразие шистоцитов. Шистоциты обычно встречаются в относительно небольшом количестве и связаны с состояниями, при которых обычно гладкая эндотелиальная выстилка или эндотелий шероховатая или неровная, и / или сосудистый просвет пересечен нитями фибрин.[18] Шистоциты обычно обнаруживаются у пациентов с гемолитическая анемия. Они также являются особенностью продвинутых железодефицитная анемия, но в этом случае наблюдаемая фрагментация, скорее всего, является результатом хрупкости клеток, полученных в этих условиях.
2. Фрагментация ДНК сперматозоидов.
В среднем у мужчины менее 4% его сперматозоидов будут содержать фрагментированную ДНК. Однако такие поступки, как курение, могут значительно увеличить фрагментацию ДНК в сперматозоидах. Существует отрицательная корреляция между процентом фрагментации ДНК и подвижностью, морфологией и концентрацией сперматозоидов. Существует также отрицательная связь между процентом сперматозоидов, содержащих фрагментированную ДНК, и скоростью оплодотворения и скоростью дробления эмбриона.[19]

использованная литература

  1. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: W.H. Фримен и, 2013. Печать.
  2. ^ Рао, Дезиразу Н., Свати Саха и Винита Кришнамурти. «АТФ-зависимые рестрикционные ферменты». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
  3. ^ Рао, Дезиразу Н., Свати Саха и Винита Кришнамурти. «АТФ-зависимые рестрикционные ферменты». Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии 64 (2000): 1-63. Распечатать.
  4. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: W.H. Фримен и, 2013. Печать.
  5. ^ Томкинсон, Алан Э. и Захари Б. Макки. «Структура и функция ДНК-лигаз млекопитающих». Исследование мутаций / Восстановление ДНК 407.1 (1998): 1-9. Распечатать.
  6. ^ Хунг, Миен-Чи, и Питер С. Вензинк. «Различные липкие концы ДНК, генерируемые рестрикционными ферментами, могут быть соединены in vitro». Nucleic Acids Research 12.4 (1984): 1863-874. Распечатать.
  7. ^ "Ch 20." Avonapbio /. N.p., n.d. Интернет. 20 ноя 2012. <http://avonapbio.pbworks.com/w/page/9429274/Ch%2020 >.
  8. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: W.H. Фримен и, 2013. Печать.
  9. ^ Смит, Аарон; Паркс, Майкл А.Ф.; Аткин-Смит, Джорджия К; Тиксейра, Рошель; Пун, Иван Х. «Разборка клеток при апоптозе». WikiJournal of Медицина. 4 (1). Дои:10.15347 / wjm / 2017.008.
  10. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: W.H. Фримен и, 2013. Печать.
  11. ^ Хуа, Ксан Дж. И Мин Сюй. «Фрагментация ДНК при апоптозе». Cell Research 10 (2000): 205-11. Природа. 17 июля 2000 г. Web. 19 ноября 2012 г.
  12. ^ Лодиш, Харви, Арнольд Берк, Крис А. Кайзер, Монти Кригер, Энтони Бретчер, Хидде Плоег, Анжелика Амон и Мэтью П. Скотт. Молекулярная клеточная биология. 7-е изд. Нью-Йорк: W.H. Фримен и, 2013. Печать.
  13. ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б.Е. Ольденбург и Джон А. Цидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
  14. ^ Джог, Нилакши Р., Лоренца Фрисони, Цинь Ши, Марк Монестиер, Сэйри Эрнандес, Джо Крафт, Элин Т. Лунинг Прак и Роберто Кариккио. «Активированная каспазой ДНКаза необходима для поддержания толерантности к ядерным аутоантигенам волчанки». Артрит и ревматизм 64.4 (2012): 1247-256. Распечатать.
  15. ^ Кучер, Даниэль, Альфред Пингоуд, Альберт Ельч и Грегор Мейс. «Идентификация пептидов, полученных из ICAD, способных ингибировать ДНКазу, активируемую каспазой». Журнал FEBS 279.16 (2012): 2917-928. Распечатать.
  16. ^ Бортнер, Карл Д., Никлас Б.Е. Ольденбург и Джон А. Цидловски. «Роль фрагментации ДНК в апоптозе». Тенденции в клеточной биологии 5.1 (1995): 21-26. Распечатать.
  17. ^ Бессман, JD. «Фрагментация красных кровяных телец. Улучшенное обнаружение и идентификация причин». Американский журнал клинической патологии 90.3 (1988): 268-73. Распечатать.
  18. ^ «Шистоциты». Шистоциты. N.p., n.d. Интернет. 20 ноя 2012. <http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/rbcmorph/schisto.htm >.
  19. ^ Сан, Дж. Г., А. Юрисикова и Р. Ф. Каспер. «Обнаружение фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты в человеческой сперме: корреляция с оплодотворением in vitro». Биология размножения 56.3 (1997): 602-07. Распечатать.