Микромасштабный термофорез - Microscale thermophoresis

Принцип технологии MST: MST выполняется в тонких капиллярах в свободном растворе, что обеспечивает условия, близкие к нативным (без иммобилизации в любом буфере, даже в сложных биожидкостях), и инструмент, не требующий обслуживания. При выполнении эксперимента MST инфракрасный лазер индуцирует микроскопический температурный градиент, и обнаруживают TRIC, а также термофорез. TRIC зависит от микросреды флуорофора, которая обычно изменяется в событиях связывания. Термофорез, движение молекулы в температурном градиенте, зависит от трех параметров, которые обычно меняются при взаимодействии. Таким образом, общий сигнал MST наносится на график зависимости от концентрации лиганда для получения кривой доза-ответ, из которой можно вывести аффинность связывания.

Микромасштабный термофорез (MST) - это технология для биофизический анализ взаимодействия между биомолекулы. Микромасштаб термофорез основан на обнаружении изменения флуоресценции мишени, вызванного температурой, в зависимости от концентрации нефлуоресцентного лиганда. Наблюдаемое изменение флуоресценции основано на двух различных эффектах. С одной стороны, он основан на изменении интенсивности, зависящей от температуры (TRIC) флуоресцентного зонда, на которое могут влиять события связывания. С другой стороны, он основан на термофорез, направленное движение частиц в микроскопическом температурный градиент. Любое изменение химического микроокружения флуоресцентного зонда, а также изменения гидратная оболочка биомолекул приводит к относительному изменению флуоресценции, обнаруживаемой при применении градиента температуры, и может использоваться для определения связывающее сродство. MST позволяет измерять взаимодействия непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (технология без иммобилизации).

Приложения

Близость

Стехиометрия

Термодинамические параметры

MST использовался для оценки энтальпийный и энтропийный вклады в биомолекулярные взаимодействия.[10]

Дополнительная информация

  • Свойство образца (однородность, агрегация, стабильность)
  • Множественные сайты привязки, сотрудничество

Технологии

MST основан на количественном обнаружении изменения флуоресценции в образце при изменении температуры. Флуоресценция целевой молекулы может быть внешней или внутренней (ароматической аминокислоты ) и изменяется температурный градиент из-за двух различных эффектов. С одной стороны, изменение интенсивности, связанное с температурой (TRIC), которое описывает внутреннее свойство флуорофоры для изменения интенсивности их флуоресценции в зависимости от температуры. На степень изменения интенсивности флуоресценции влияет химическая среда флуоресцентного зонда, которая может быть изменена в событиях связывания из-за конформационные изменения или близость лиганды.[11][12] С другой стороны, MST также основан на направленном движении молекул по температурным градиентам - эффекту, называемому термофорезом. Пространственная разница температур ΔT приводит к изменению концентрации молекул в области повышенной температуры, количественно определяемой коэффициентом Соре SТ: cгорячей/ cхолодный = exp (-SТ ΔT).[13][14] И TRIC, и термофорез вносят вклад в регистрируемый сигнал при измерениях MST следующим образом: ∂ / ∂T (cF) = c∂F / ∂T + F∂c / ∂T. Первый член в этом уравнении c∂F / ∂T описывает TRIC как изменение интенсивности флуоресценции (F) как функцию температуры (T), тогда как второй член F∂c / ∂T описывает термофорез как изменение концентрации частиц (c) как функция температуры. Термофорез зависит от границы раздела между молекулой и растворителем. В условиях постоянного буфера термофорез исследует размер, заряд и энтропию сольватации молекул. Термофорез флуоресцентно меченой молекулы A обычно значительно отличается от термофореза комплекса молекула-мишень AT из-за различий в размере, заряде и энтропии сольватации. Эта разница в термофорезе молекул используется для количественной оценки связывания в экспериментах по титрованию при постоянных условиях буфера.

Термофоретическое движение флуоресцентно меченой молекулы измеряется путем мониторинга флуоресценция распределение F внутри капилляра. Микроскопический температурный градиент создается ИК-лазером, который фокусируется в капилляре и сильно поглощается водой. Температура водного раствора в лазерном пятне повышается на ΔT = 1-10 К. Перед включением ИК-лазера происходит однородное распределение флуоресценции Fхолодный наблюдается внутри капилляра. Когда ИК-лазер включен, в одном и том же временном интервале возникают два эффекта, которые вносят вклад в новое распределение флуоресценции F.горячей. Термическая релаксация вызывает зависящее от связывания падение флуоресценции красителя из-за его локальной реакции, зависящей от окружающей среды, на скачок температуры (TRIC). В то же время молекулы обычно перемещаются из области локального нагрева во внешние холодные области. Локальная концентрация молекул уменьшается в нагретой области до достижения стационарного распределения.

Пока масса распространение D диктует кинетику истощения, SТ определяет установившееся отношение концентраций cгорячей/ cхолодный= exp (-SТ ΔT) ≈ 1-SТ ΔT при повышении температуры ΔT. Нормализованная флуоресценция Fнорма= Fгорячей/ Fхолодный измеряет в основном этот коэффициент концентрации в дополнение к TRIC ∂F / ∂T. В линейном приближении находим: Fнорма= 1 + (∂F / ∂T-SТ) ΔT. Из-за линейности интенсивности флуоресценции и термофоретического истощения нормированная флуоресценция несвязанной молекулы Fнорма(A) и связанный комплекс Fнорма(AT) накладываются линейно. Обозначая x долю молекул, связанных с мишенями, изменяющийся сигнал флуоресценции во время титрования мишени T определяется выражением: Fнорма= (1-х) Fнорма(А) + х Fнорма(В).[11]

Количественные параметры связывания получают с помощью серийного разведения связывающего субстрата. Построив Fнорма против логарифма различных концентраций серии разведений получают сигмоидальную кривую связывания. Эта кривая связывания может быть непосредственно аппроксимирована нелинейным решением закон массового действия, с константой диссоциации KD как результат.[15][16][17]

использованная литература

  1. ^ Асмари М., Ратих Р., Альхазми Х.А., Эль Диб С. (февраль 2018 г.). «Термофорез для характеристики биомолекулярного взаимодействия» (PDF). Методы. 146: 107–119. Дои:10.1016 / j.ymeth.2018.02.003. PMID  29438829.
  2. ^ Мюллер AM, Breitsprecher D, Duhr S, Baaske P, Schubert T, Längst G (2017). "Микро Масштаб Термофорез: быстрый и точный метод количественной оценки взаимодействий белок-нуклеиновая кислота в растворе ». Термофорез MicroScale: быстрый и точный метод количественной оценки взаимодействий белок-нуклеиновая кислота в растворе. Методы молекулярной биологии. 1654. С. 151–164. Дои:10.1007/978-1-4939-7231-9_10. ISBN  978-1-4939-7230-2. PMID  28986788.
  3. ^ Филарски М., Циллнер К., Арайя I, Виллар-Гареа А., Меркл Р., Ленгст Г., Немет А. (2015). «Удлиненный АТ-крючок - это новый мотив связывания РНК». РНК Биология. 12 (8): 864–76. Дои:10.1080/15476286.2015.1060394. ЧВК  4615771. PMID  26156556.
  4. ^ а б Зайдель С.А., Дейкман П.М., Леа В.А., ван ден Богаарт Г., Джерабек-Виллемсен М., Лазич А. и др. (2013). «Микромасштабный термофорез позволяет количественно оценить биомолекулярные взаимодействия в ранее сложных условиях». Методы. 59 (3): 301–15. Дои:10.1016 / j.ymeth.2012.12.005. ЧВК  3644557. PMID  23270813.
  5. ^ Зайдель С.А., Винкен С.Дж., Гайсслер С., Джерабек-Виллемсен М., Дюр С., Райтер А., Траунер Д., Браун Д., Баске П. (2012). «Микромасштабный термофорез без метки позволяет различать сайты и сродство связывания белок-лиганд». Энгью. Chem. Int. Эд. Англ.. 51 (42): 10656–9. Дои:10.1002 / anie.201204268. ЧВК  3588113. PMID  23001866.
  6. ^ Linke P, Amaning K, Maschberger M, Vallee F, Steier V, Baaske P, Duhr S, Breitsprecher D, Rak A (апрель 2016 г.). «Автоматизированный подход к скринингу термофореза на микромасштабах для обнаружения свинца на основе фрагментов». Журнал биомолекулярного скрининга. 21 (4): 414–21. Дои:10.1177/1087057115618347. ЧВК  4800460. PMID  26637553.
  7. ^ Jerabek-Willemsen M, Wienken CJ, Braun D, ​​Baaske P, Duhr S (август 2011 г.). «Исследования молекулярного взаимодействия с использованием термофореза на микромасштабах». Технологии анализа и разработки лекарств. 9 (4): 342–53. Дои:10.1089 / adt.2011.0380. ЧВК  3148787. PMID  21812660.
  8. ^ Дейкман П.М., Уоттс А. (ноябрь 2015 г.). «Липидная модуляция ранних событий передачи сигналов рецептора, связанного с G-белком». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Биомембраны. 1848 (11 Pt A): 2889–97. Дои:10.1016 / j.bbamem.2015.08.004. PMID  26275588.
  9. ^ Виланова О., Миттаг Дж. Дж., Келли П. М., Милани С., Доусон К. А., Редлер Дж. О., Францезе Г. (декабрь 2016 г.). «Понимание кинетики образования короны из белков и наночастиц». САУ Нано. 10 (12): 10842–10850. Дои:10.1021 / acsnano.6b04858. ЧВК  5391497. PMID  28024351.
  10. ^ Jerabek-Willemsen M, André T., Wanner A, Roth HM, Duhr S, Baaske P, Breitsprecher D (2014). «MicroScale Thermophoresis: анализ взаимодействия и не только». Журнал молекулярной структуры. 1077: 101–113. Bibcode:2014JMoSt1077..101J. Дои:10.1016 / j.molstruc.2014.03.009.
  11. ^ а б Baaske P, Wienken CJ, Reineck P, Duhr S, Braun D (2010). «Оптический термофорез для количественной оценки буферной зависимости связывания аптамера». Энгью. Chem. Int. Эд. Англ.. 49 (12): 1–5. Дои:10.1002 / anie.200903998. PMID  20186894. Сложить резюме – Phsyorg.com.
  12. ^ Гупта AJ, Duhr S, Baaske P (2018). Микромасштабный термофорез (MST). Энциклопедия биофизики. С. 1–5. Дои:10.1007/978-3-642-35943-9_10063-1. ISBN  9783642359439.
  13. ^ Duhr S, Braun D (2006). «Почему молекулы движутся по температурному градиенту». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 103 (52): 19678–82. Bibcode:2006PNAS..10319678D. Дои:10.1073 / pnas.0603873103. ЧВК  1750914. PMID  17164337.
  14. ^ Райнек П., Винкен С.Дж., Браун Д. (2010). «Термофорез одноцепочечной ДНК». Электрофорез. 31 (2): 279–86. Дои:10.1002 / elps.200900505. PMID  20084627. S2CID  36614196.
  15. ^ Винкен CJ, Baaske P, Rothbauer U, Braun D, ​​Duhr S (2010). «Анализы связывания белков в биологических жидкостях с использованием термофореза на микроуровне». Nat Commun. 1 (7): 100. Bibcode:2010 НатКо ... 1..100 Вт. Дои:10.1038 / ncomms1093. PMID  20981028.
  16. ^ Baaske P, Wienken C, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Оптически созданный термофорез для биоанализа] (PDF). Биофотоник (на немецком языке): 22–24.[мертвая ссылка ]
  17. ^ Винкен CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011). «Кривые термофоретического плавления позволяют количественно оценить конформацию и стабильность РНК и ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 39 (8): e52. Дои:10.1093 / nar / gkr035. ЧВК  3082908. PMID  21297115.