Гель-электрофорез белков - Gel electrophoresis of proteins

Белки разделены SDS-СТРАНИЦА, Кумасси бриллиантовый синий окрашивание

Белковый электрофорез это метод анализа белков в жидкости или экстракте. Электрофорез можно проводить с небольшим объемом образца несколькими альтернативными способами с поддерживающей средой или без нее: Электрофорез в полиакриламидном геле в SDS (коротко: гель-электрофорез, ПААГ или SDS-электрофорез), электрофорез в свободном потоке, электрофокусировка, изотахофорез, аффинный электрофорез, иммуноэлектрофорез, контрэлектрофорез, и капиллярный электрофорез. Каждый метод имеет множество вариаций с индивидуальными преимуществами и ограничениями. Гель-электрофорез часто выполняется в сочетании с электроблоттинг иммуноблоттинг чтобы предоставить дополнительную информацию о конкретном белке. Из-за практических ограничений электрофорез белков обычно не подходит в качестве препаративного метода.[требуется разъяснение ]

Денатурирующие гелевые методы

SDS-СТРАНИЦА

Основная статья: SDS-СТРАНИЦА

SDS-PAGE, додецилсульфат натрия электрофорез в полиакриламидном геле, описывает набор связанных методов для разделения белки согласно их электрофоретическая подвижность (функция молекулярной массы полипептидной цепи), в то время как в денатурированный (в разложенном) состоянии. В большинстве белков связывание SDS с полипептидной цепью обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза.

SDS - сильнодействующее моющее средство, используемое для денатурирования нативных белков в развернутые индивидуальные полипептиды. Когда белковая смесь нагревается до 100 ° C в присутствии SDS, моющее средство оборачивается вокруг основы полипептида. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержневидными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть одинаковым суммарным отрицательным зарядом на единицу длины. Электрофоретическая подвижность этих белков будет линейной функцией логарифмы их молекулярных масс.

Нативные гелевые методы

Нативные гели, также известные как неденатурирующие гели, анализируют белки, которые все еще находятся в свернутом состоянии. Таким образом, электрофоретическая подвижность зависит не только от отношения заряда к массе, но также от физической формы и размера белка.

Синяя родная СТРАНИЦА

BN-PAGE - родной СТРАНИЦА техника, где Кумасси бриллиантовый синий краситель обеспечивает необходимые обвинения к белковым комплексам для электрофоретического разделения.[1][2] Недостатком кумасси является то, что при связывании с белками он может действовать как моющее средство вызывая комплексы диссоциировать. Еще один недостаток - это возможность закалка из хемолюминесценция (например, в последующих вестерн-блот обнаружения или анализа активности) или флуоресценция белков с протезные группы (например. гем или же хлорофилл ) или помеченные флуоресцентными красителями.

Очистить родную СТРАНИЦУ

CN-PAGE (обычно называемый Native PAGE) разделяет кислый водорастворимый и мембранный белки в полиакриламид градиентный гель. Он не использует заряженный краситель, поэтому электрофоретическая подвижность белков в CN-PAGE (в отличие от метода сдвига заряда BN-PAGE) связана с внутренним зарядом белков.[3] Расстояние миграции зависит от заряда белка, его размера и размера пор геля. Во многих случаях этот метод имеет более низкое разрешение, чем BN-PAGE, но CN-PAGE дает преимущества, когда Кумасси краситель может помешать дальнейшим аналитическим методам, например, он был описан как очень эффективный метод микромасштабного разделения для FRET анализы.[4] Кроме того, CN-PAGE мягче, чем BN-PAGE, поэтому он может сохранять лабильные супрамолекулярные сборки мембранный белок комплексы, которые диссоциированный в условиях BN-PAGE.

Количественная родная СТРАНИЦА

Основная статья: QPNC-PAGE

В сложенный белковые комплексы представляющие интерес разделяются чисто и предсказуемо благодаря особым свойствам полиакриламидного геля. Разделенные белки непрерывно элюируются физиологическим элюентом и транспортируются в коллектор фракций. В четырех-пяти фракциях PAGE каждый металлический кофактор может быть идентифицирован и абсолютно количественно определен с помощью высокого разрешения. ИСП-МС. Соответствующие структуры изолированных металлопротеины можно определить по решению ЯМР спектроскопия.[5]

Буферные системы

Постулируемая миграция белков в гелевой системе Лэммли A: Укладывающий гель, B: Рассасывающийся гель, o: нанесение образца c: неоднородности в буфере и электрофоретической матрице

Большинство белковых разделений выполняется с использованием «прерывистого» (или DISC) буфер система, которая значительно увеличивает резкость полос внутри геля. Во время электрофореза в прерывистой гелевой системе на ранней стадии электрофореза образуется ионный градиент, который заставляет все белки фокусироваться в единую резкую полосу. Формирование ионного градиента достигается за счет выбора значения pH, при котором ионы буфера заряжены только умеренно по сравнению с белками, покрытыми SDS. Эти условия создают среду, в которой Кольрауша реакции определяют молярная проводимость. В результате белки, покрытые SDS, концентрируются в несколько раз в тонкой зоне размером порядка 19 мкм в течение нескольких минут. На этом этапе все белки мигрируют с одинаковой скоростью за счет изотахофорез. Это происходит в области геля, которая имеет более крупные поры, так что гелевая матрица не задерживает миграцию во время фокусировки или «наложения».[6][7] Разделение белков по размеру достигается в нижней, «разрешающейся» области геля. Разделительный гель обычно имеет гораздо меньший размер пор, что приводит к эффекту просеивания, который теперь определяет электрофоретическую подвижность белков. В то же время разделяющая часть геля также имеет значение pH, при котором ионы буфера в среднем несут больший заряд, заставляя их «опережать» белки, покрытые SDS, и устранять ионный градиент и тем самым эффект суммирования.

Очень распространенной прерывистой буферной системой является трис-глицин или "Лаеммли "система, которая складывается в pH 6,8 и разрешается pH ~ 8,3-9,0. Недостатком этой системы является то, что эти значения pH могут способствовать дисульфид образование связи между цистеин остатков в белках, потому что pKa цистеина колеблется от 8 до 9 и потому, что восстанавливающий агент, присутствующий в загрузочном буфере, не мигрирует вместе с белками. Последние достижения в технологии буферизации облегчают эту проблему, разрешая белки при pH значительно ниже pKa цистеина (например, бис-трис, pH 6,5) и включают восстановители (например, бисульфит натрия), которые переходят в гель перед белками, чтобы поддерживать восстановительную среду. Дополнительным преимуществом использования буферов с более низкими значениями pH является то, что акриламидный гель более стабилен при более низких значениях pH, поэтому гели можно хранить в течение длительных периодов времени перед использованием.[8][9]

SDS-градиентный гель-электрофорез белков

При приложении напряжения анионы (и отрицательно заряженные молекулы образца) мигрируют к положительному электроду (аноду) в нижней камере, ведущий ион Cl− (высокая подвижность и высокая концентрация); глицинат является замыкающим ионом (низкая подвижность и низкая концентрация). Частицы SDS-белка не перемещаются свободно на границе между Cl− гелевого буфера и Gly− катодного буфера. Фридрих Кольрауш обнаружили, что Закон Ома также относится к растворенным электролиты. Из-за падения напряжения между Cl− и глициновые буферы, белки сжимаются (складываются) в тонкие слои микрометра.[10] Граница движется через градиент пор, и стек белков постепенно диспергируется из-за увеличения сопротивления трения гелевой матрицы. Укладка и разборка происходит непрерывно в градиентном геле для каждого белка в разных местах. Для полного разделения белка концентрация полиакриламидного геля должна превышать 16% T. Двухгелевая система «Laemmli» представляет собой простой градиентный гель. Неравномерность pH буферов не имеет значения для качества разделения, и «стекинг-гель» с другим pH не требуется.

Визуализация

Самая популярная белковая окраска - это Кумасси бриллиантовый синий. Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенного в гель, можно удалить, обесцвечивая тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на прозрачном фоне.

Когда требуется более чувствительный метод, чем окрашивание Кумасси, обычно используется окрашивание серебром. Окрашивание серебром - чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях, но также может визуализировать нуклеиновые кислоты или полисахариды.

На рынке доступны методы визуализации без использования красителей, таких как кумасси и серебро. Например Лаборатории Bio-Rad продает гели без пятен для гель-электрофореза в SDS-PAGE. В качестве альтернативы обратимые флуоресцентные красители от Биосистемы Azure например, AzureRed или Azure TotalStain Q.

Аналогично гель-электрофорезу нуклеиновой кислоты, следящий краситель часто используется. В буфер для образца обычно включают анионные красители с известной электрофоретической подвижностью. Очень распространенный следящий краситель Бромфеноловый синий. Этот краситель окрашен при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду. Будучи высокомобильной молекулой, он опережает большинство белков.

Медицинские приложения

Схематическое изображение геля для электрофореза белков.
Электрофорез сывороточного протеина показывает парапротеин (пик в гамма-зоне) у пациента с множественная миелома.
Основные статьи: Электрофорез белков сыворотки и Белки крови

В лекарство, электрофорез белков это метод анализа белки в основном в сыворотка крови. До повсеместного использования гель-электрофорез, электрофорез белков выполняли как электрофорез в свободном потоке (на бумаге) или как иммуноэлектрофорез.

Традиционно два класса белки крови считаются: сывороточный альбумин и глобулин. Обычно они равны по пропорции, но альбумин поскольку молекула намного меньше и имеет слабый отрицательный заряд, что приводит к накоплению альбумина на электрофоретическом геле. Небольшая полоса перед альбумином представляет транстиретин (также называемый преальбумином). Некоторые лекарственные препараты или химические вещества в организме могут вызвать образование собственной полосы, но обычно она небольшая. Аномальные полосы (шипы) видны в моноклональная гаммопатия неустановленного значения и множественная миелома, и полезны при диагностике этих состояний.

Глобулины классифицируются по рисунку полос (с их основными представителями):

Обычная медицинская процедура в настоящее время включает определение множества белков в плазме, включая гормоны и ферменты, некоторые из которых также определяются с помощью электрофореза. Однако гель-электрофорез - это в основном инструмент исследования, в том числе и в случае белков крови.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Schägger, H .; Ягов, Г. (1991). «Синий нативный электрофорез для выделения комплексов мембранных белков в ферментативно активной форме». Анальный. Биохим. 199 (2): 223–231. Дои:10.1016 / 0003-2697 (91) 90094-А. PMID  1812789.
  2. ^ Wittig, I .; Braun, H.P .; Шеггер, Х. (2006). "Голубая родная СТРАНИЦА". Nat. Protoc. 1 (1): 418–428. Дои:10.1038 / nprot.2006.62. PMID  17406264.
  3. ^ Wittig, I .; Шеггер, Х. (ноябрь 2005 г.). «Преимущества и недостатки четкой родной страницы». Протеомика. 5 (17): 4338–46. Дои:10.1002 / pmic.200500081. PMID  16220535. Архивировано из оригинал на 2013-01-05.
  4. ^ Gavin P.D .; Девениш Р.Дж .; Прескотт М. (2003). "FRET показывает изменения в F1- взаимодействие стебля статора при активности F1F0-АТФ-синтаза ». Biochim Biophys Acta. 1607 (2–3): 167–79. Дои:10.1016 / j.bbabio.2003.09.013. PMID  14670607.
  5. ^ Кастенхольц, Б. (2004). «Препаративный нативный непрерывный электрофорез в полиакриламидном геле (PNC ‐ PAGE): эффективный метод выделения кофакторов кадмия в биологических системах». Протеиновый салат. 37 (4): 657–65. Дои:10.1081 / AL-120029742. S2CID  97636537.
  6. ^ Орнштейн Л. (декабрь 1964 г.). «Дисковый электрофорез. I. Предпосылки и теория». Летопись Нью-Йоркской академии наук. 121 (2): 321–349. Bibcode:1964НЯСА.121..321О. CiteSeerX  10.1.1.140.7598. Дои:10.1111 / j.1749-6632.1964.tb14207.x. PMID  14240533.
  7. ^ Дэвис Б.Дж. (декабрь 1964 г.). «Дисковый электрофорез. 2, Метод и применение к белкам сыворотки крови человека». Анна. Акад. Наука. 121 (2): 404–427. Bibcode:1964НЯСА.121..404Д. Дои:10.1111 / j.1749-6632.1964.tb14213.x. PMID  14240539.
  8. ^ Шеггер Х, фон Ягов Г (1987). «Электрофорез в трицин-додецилсульфат-полиакриламидном геле для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа». Анальный. Биохим. 166 (2): 368–379. Дои:10.1016/0003-2697(87)90587-2. PMID  2449095.
  9. ^ Вильтфанг Дж, Арольд Н., Нойхофф В. (1991). «Новая многофазная буферная система для электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия белков и пептидов с молекулярными массами 100000-1000 и их обнаружения с пикомолярной чувствительностью». Электрофорез. 12 (5): 352–366. Дои:10.1002 / elps.1150120507. PMID  1718736.
  10. ^ Кольрауш Ф (1897). "Ueber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen". Annalen der Physik und Chemie. 62 (10): 209–239. Bibcode:1897AnP ... 298..209K. Дои:10.1002 / andp.18972981002.
  11. ^ Minde DP (2012). «Определение биофизической стабильности белков в лизатах с помощью анализа быстрого протеолиза, FASTpp». PLOS ONE. 7 (10): e46147. Bibcode:2012PLoSO ... 746147M. Дои:10.1371 / journal.pone.0046147. ЧВК  3463568. PMID  23056252.

внешняя ссылка