Нисходящая протеомика - Top-down proteomics - Wikipedia

Нисходящая и восходящая протеомика

Нисходящая протеомика это метод белок идентификация, которая либо использует ионный захват масс-спектрометр для хранения изолированного белкового иона для измерения массы и тандемная масс-спектрометрия (МС / МС) анализ[1][2] или другие методы очистки белка, такие как двумерный гель-электрофорез в сочетании с MS / MS[3]. Сверху вниз протеомика способен идентифицировать и количественно определять уникальные протеоформы посредством анализа интактных белков.[4] Название происходит от похожего подхода к секвенированию ДНК.[5] Во время масс-спектрометрии интактные белки обычно ионизируются ионизация электрораспылением и попал в ловушку Ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (Ловушка Пеннинга )[6], квадрупольная ионная ловушка (Пол ловушка) или Орбитальная ловушка масс-спектрометр. Фрагментация для тандемной масс-спектрометрии выполняется диссоциация с захватом электронов или же диссоциация с переносом электрона. Эффективное фракционирование имеет решающее значение для обработки образцов перед протеомикой, основанной на масс-спектрометрии. Протеомный анализ обычно включает переваривание интактных белков с последующей идентификацией предполагаемых белков с использованием масс-спектрометрии (РС).[7] Протеомика МС сверху вниз (негелевая) исследует структуру белка путем измерения неповрежденной массы с последующей прямой диссоциацией ионов в газовой фазе.[8]


Преимущества

  • Основные преимущества нисходящего подхода включают способность обнаруживать продукты разложения, изоформы белка, варианты последовательностей, комбинации посттрансляционных модификаций, а также упрощенные процессы нормализации и количественной оценки данных.
  • Нисходящая протеомика в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле может помочь дополнить восходящий протеомный подход. Нисходящие протеомные методы могут помочь выявить большие отклонения от прогнозов, и они были очень успешно реализованы путем комбинирования гель-элюции Фракционирование на основе жидкости с захватом, фракционирование с электрофорезом, осаждение белков и ВЭЖХ с обращенной фазой с ионизацией электрораспылением и МС / МС.[9]
  • Характеристика малых белков представляет собой серьезную проблему для восходящей протеомики из-за невозможности генерировать достаточное количество триптических пептидов для анализа. Протеомика «сверху вниз» позволяет детектировать белки с низкой массой, тем самым увеличивая репертуар известных белков.[10] Пока Восходящая протеомика объединяет расщепленные продукты всех протеоформ, продуцируемых геном, в единую пептидную карту продукта полноразмерного гена для табулирования и количественной оценки экспрессируемых белков, основная сила нисходящей протеомики заключается в том, что она позволяет исследователям количественно отслеживать одну или несколько протеоформ из несколько образцов и вырезать эти протеоформы для химического анализа.[9]

Недостатки

  • В недавнем прошлом подход «сверху вниз» сводился к анализу отдельных белков или простых смесей, тогда как сложные смеси и белки анализировались более устоявшимися методами, такими как протеомика «снизу вверх». Кроме того, идентификация белков и характеристика протеоформ в подходе TDP (протеомика сверху вниз) могут страдать от проблемы динамического диапазона, когда одни и те же высокоразвитые виды многократно фрагментируются.[4]
  • Хотя нисходящая протеомика может работать с относительно высокой производительностью для успешного картирования протеомного покрытия на большом уровне, скорость идентификации новых белков после начальных раундов довольно резко снижается.[4]
  • Нисходящий протеомный опрос может преодолеть проблемы идентификации отдельных белков, но не был достигнут в больших масштабах из-за отсутствия методов фракционирования интактных белков, которые интегрированы с тандемной масс-спектрометрией.[7]

Исследования и использование

Исследование первое: количественное определение и идентификация тысяч протеоформ человека ниже 30 кДа

  • Исследователи провели исследование протеоформ человека ниже 30 кДа, использовали первичные человеческие фибробласты IMR90, содержащие конструкцию с функцией Ras, которые были выращены в среде.
  • Вы выбрали использование протеомики «сверху вниз» для характеристики этих протеоформ, потому что в настоящее время это лучший метод для интактных белков, поскольку, как я уже говорил, метод «снизу вверх» переваривает белок и не дает четкого изображения отдельных интактных протеоформ.
  • Top Down Proteomics способна идентифицировать и количественно определять уникальные протеоформы с помощью анализа интактных белков. Количественный анализ "сверху вниз" выявил изменения в количестве 1038 цитоплазматических протеоформ.[4]

Исследование второе: сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрического фокусирующего гель-электрофореза для виртуальной двумерной протеомики на основе геля

  • Исследователи использовали нисходящую протеомику, потому что могли идентифицировать точные протеоформы интактных белков, а не восходящий подход, который дает фрагментные ионы пептидов.
  • В этом исследовании использовался виртуальный 2D гель вместе с масс-спектрометрией для разделения смесей белков. MALDI - это компьютерная программа, которая генерирует неповрежденные массы белков в каждой изоэлектрической точке. Все началось с изображения выделенного геля IPG-IEF (изоэлектрическая фокусировка), которое затем было проанализировано MALDI.[9]
  • Нисходящая протеомика MALDI-TOF / TOF-MS более устойчива к примесям; не требует извлечения, очистки и разделения биомаркеров; и может применяться непосредственно к интактным микроорганизмам.[11]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Sze SK, Ge Y, Oh H, McLafferty FW (2002). «Нисходящая масс-спектрометрия белка 29 кДа для характеристики любой посттрансляционной модификации с точностью до одного остатка». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 99 (4): 1774–9. Bibcode:2002PNAS ... 99.1774S. Дои:10.1073 / pnas.251691898. ЧВК  122269. PMID  11842225.
  2. ^ Келлехер Н.Л. (2004). «Нисходящая протеомика». Анальный. Chem. 76 (11): 197A – 203A. Дои:10.1021 / ac0415657. PMID  15190879.
  3. ^ Райт EP, Партридж MA, Padula MP, Гаучи VJ, Malladi CS, Coorsen JR (2014). «Нисходящая протеомика: улучшение 2D-гель-электрофореза от обработки тканей до высокочувствительного обнаружения белков». Протеомика. 14: 872–889. Дои:10.1002 / pmic.201300424.
  4. ^ а б c d Дурбин, Кеннет Роберт; Форнелли, Лука; Fellers, Ryan T .; Doubleday, Питер Ф .; Нарита, Масаши; Келлехер, Нил Л. (2016). «Количественное определение и идентификация тысяч протеоформ человека ниже 30 кДа». Журнал протеомных исследований. 15 (3): 976–982. Дои:10.1021 / acs.jproteome.5b00997. ЧВК  4794255. PMID  26795204.
  5. ^ Смит К.Л., Кантор С.Р. (1989). «Развитие стратегий для создания физических карт хромосом млекопитающих». Геном. 31 (2): 1055–8. Дои:10.1139 / g89-181. PMID  2698822.
  6. ^ Богданов Б, Смит RD (2005). «Протеомика методом масс-спектрометрии FTICR: сверху вниз и снизу вверх». Обзоры масс-спектрометрии. 24 (2): 168–200. Bibcode:2005MSRv ... 24..168B. Дои:10.1002 / mas.20015. PMID  15389855.
  7. ^ а б Тран, Джон С .; Замдборг, Леонид; Альф, Дороти Р .; Ли, Джи Ын; Катерман, Адам Д .; Durbin, Kenneth R .; Типтон, Джеремайя Д .; Веллаичами, Адаиккалам; Келли, Джон Ф. (2011-12-08). «Картирование интактных изоформ белка в режиме открытия с использованием нисходящей протеомики». Природа. 480 (7376): 254–258. Bibcode:2011Натура.480..254Т. Дои:10.1038 / природа10575. ISSN  0028-0836. ЧВК  3237778. PMID  22037311.
  8. ^ Парки, Брайан А .; Цзян, Лихуа; Thomas, Paul M .; Wenger, Craig D .; Рот, Майкл Дж .; Бойн, Майкл Т .; Берк, Патрисия В .; Кваст, Курт Э .; Келлехер, Нил Л. (2007). "Нисходящая протеомика в хроматографической временной шкале с использованием гибридных масс-спектрометров с преобразованием Фурье с линейной ионной ловушкой". Аналитическая химия. 79 (21): 7984–7991. Дои:10.1021 / ac070553t. ЧВК  2361135. PMID  17915963.
  9. ^ а б c Лонес, Карен; Quebbemann, Neil R .; Лю, Кейт; Кобзефф, Фред; Loo, Joseph A .; Огожалек Лоо, Рэйчел Р. (2016). «Сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрического фокусирующего гель-электрофореза для виртуальной двумерной протеомики на основе геля». Методы. 104: 163–169. Дои:10.1016 / j.ymeth.2016.01.013. ЧВК  4930893. PMID  26826592.
  10. ^ Lorenzatto, Karina R .; Ким, Кёнгон; Нтай, Иоанна; Палудо, Габриэла П .; Камарго де Лима, Джеферсон; Thomas, Paul M .; Kelleher, Neil L .; Феррейра, Энрике Б. (06.11.2015). «Протеомика сверху вниз выявляет зрелые протеоформы, экспрессирующиеся в субклеточных фракциях Preadult Stage Echinococcus granulosus». Журнал протеомных исследований. 14 (11): 4805–4814. Дои:10.1021 / acs.jproteome.5b00642. ISSN  1535-3907. ЧВК  4638118. PMID  26465659.
  11. ^ Демирев, Пламен А .; Фельдман, Эндрю Б .; Ковальски, Пол; Лин, Джеффри С. (2005). «Нисходящая протеомика для быстрой идентификации интактных микроорганизмов». Аналитическая химия. 77 (22): 7455–7461. Дои:10.1021 / ac051419g. PMID  16285700.

Библиография