Пятно по Хёхсту - Hoechst stain

Химическая структура красителей Hoechst.

Пятна Hoechst являются частью семьи синих флуоресцентный красители привыкший пятно ДНК.[1][2] Эти Бис-бензимиды изначально были разработаны Hoechst AG, в котором пронумерованы все их соединения, так что краситель Hoechst 33342 это 33 342 соединения, произведенные компанией. Существует три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми и имеют похожие возбуждение –спектры излучения.

Молекулярные характеристики

Спектры возбуждения-излучения красителей Хёхста.

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовый свет на отметке 350 нм, и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг спектр излучения максимум при 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальное излучение флуоресценции в диапазоне 510–540 нм. Пятна Hoechst можно возбудить ксенон или же ртутно-дуговая лампа или с ультрафиолетом лазер. Существует значительный Стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и испускания, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых несколько флуорофоры используются. Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с увеличением pH из растворитель.[3]

Красители Hoechst растворимы в воды и в органических растворители Такие как диметилформамид или же диметилсульфоксид. Концентрация может достигать 10 мг / мл. Водные растворы стабильны при 2–6 ° C не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы вместо этого замораживают при -20 ° C или ниже.[3]

Hoechst 33258 (пурпурный) привязан к малой бороздке ДНК (зеленый и синий). Из PDB: 264D​.

Красители связываются с малая бороздка двухцепочечной ДНК с предпочтением последовательностей, богатых аденин и тимин. Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию.[4] Красители Hoechst являются клеточнымипроницаемый и может связываться с ДНК в живом или фиксированные ячейки. Таким образом, эти пятна часто называют суправитальный, что означает, что живые клетки выживают после обработки этими соединениями. Клетки, экспрессирующие специфические АТФ-связывающий кассетный транспортер белки может также активно выводить эти пятна со своих цитоплазма.[нужна цитата ]

Приложения

Передача изображения HeLa клетки с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Крайняя левая ячейка находится в прометафаза этап митоз; это хромосомы ярко флуоресцируют, потому что содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивированных нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец обрабатывали красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На рисунке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, указывающей на спонтанную активацию образования внеклеточных ловушек нейтрофилов у пациентов с БА, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг / мл обычно используется для окрашивания ДНК в бактерии или же эукариот клетки. Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 ° C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленая флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых.[3] Красители Hoechst часто используются как заменители другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI.

Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI:

  • Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток.[5]
  • Дополнительные этильная группа красителей Hoechst делает их более проницаемыми для клеток.[нужна цитата ]
  • Существуют красители, окрашивающие ядра, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания.[нужна цитата ]

Hoechst 33342 и 33258 являются закаленный к бромдезоксиуридин (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую проницаемость для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве заменителя тимидин. Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь оптимального места связывания. Связывание красителей Hoechst даже сильнее с BrdU-замещенной ДНК; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга клеточный цикл прогрессия.[6][7]

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих областях:

Отток Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в том, что называется побочное население. Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным хехстом, через красный и синий фильтры и нанесением красных и синих хехстов друг на друга.[нужна цитата ]

Токсичность и безопасность

Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают Репликация ДНК в течение деление клеток. Следовательно, они потенциально мутагенный и канцерогенный, поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними и их утилизации. Окраска Hoechst используется для отсортировать сперму у домашнего скота и людей. Его безопасность обсуждалась.[12][13]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Уиллард, ВЧ; Scher, CD (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst». Журнал гистохимии и цитохимии. 23 (7): 493–505. Дои:10.1177/23.7.1095650. PMID  1095650.
  2. ^ Latt, SA; Стеттен, Г. (январь 1976 г.). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты». Журнал гистохимии и цитохимии. 24 (1): 24–33. Дои:10.1177/24.1.943439. PMID  943439.
  3. ^ а б c «Пятна Хёхста» (PDF). Инвитрогрен (молекулярные зонды). Архивировано из оригинал (PDF) 19 апреля 2009 г.
  4. ^ Португалия, Дж; Уоринг, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение сайтов связывания ДНК для 4 ', 6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование отпечатков пальцев». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура и экспрессия гена. 949 (2): 158–68. Дои:10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID  2449244.
  5. ^ BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Бектон, Дикинсон и компания.
  6. ^ Кубби, М; Рабинович, П.С. (январь 1983 г.). «Проточный цитометрический анализ факторов, влияющих на эффект тушения BrdUrd-Hoechst в культивируемых фибробластах и ​​лимфоцитах человека». Цитометрия. 3 (4): 276–81. Дои:10.1002 / cyto.990030408. PMID  6185287.
  7. ^ Breusegem, SY; Клегг, РМ; Loontiens, FG (1 февраля 2002 г.). «Специфичность базовой последовательности Hoechst 33258 и связывания DAPI с пятью (A / T) 4 участками ДНК с кинетическими доказательствами для более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии. 315 (5): 1049–61. Дои:10.1006 / jmbi.2001.5301. PMID  11827475.
  8. ^ Иэн Джонсон, Мишель Т.З. Спенс, изд. (2011). Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Invitrogen. ISBN  978-0-9829279-1-5.
  9. ^ Кубби, М. (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание кластоген-индуцированного повреждения хроматина в G0 / G1 лимфоцитах путем нестехиометрического связывания флуорохрома Hoechst». Цитометрия. 11 (3): 386–94. Дои:10.1002 / cyto.990110309. PMID  1692786.
  10. ^ а б Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (23 декабря 1987 г.). «Новый чувствительный флуориметрический метод окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК». Исследования нуклеиновых кислот. 15 (24): 10589. Дои:10.1093 / nar / 15.24.10589. ЧВК  339970. PMID  2447564.
  11. ^ Sterzel, W; Бедфорд, П.; Айзенбранд, Г. (июнь 1985 г.). «Автоматическое определение ДНК с помощью флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия. 147 (2): 462–7. Дои:10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID  2409841.
  12. ^ Эшвуд-Смит, М.Дж. (1994). «Безопасность отбора спермы человека методом проточной цитометрии». Репродукция человека. Oxford University Press. 9 (5): 757–759. Дои:10.1093 / oxfordjournals.humrep.a138589. PMID  7929716.
  13. ^ Parrilla, I; Васкес, Дж. М; Cuello, C; Гил, Массачусетс; Рока, Дж; Ди Берардино, Д; Мартинес, EA (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие УФ-лазера не вызывают генотоксических эффектов в сортированных по потоку сперматозоидах хряков». Размножение. 128 (5): 615–621. Дои:10.1530 / rep.1.00288. PMID  15509707.

внешняя ссылка