Дезамидирование - Deamidation

Реакция деамидирования Asn-Gly (вверху справа) до Asp-Gly (слева) или изо (Asp) -Gly (зеленый внизу справа).

Дезамидирование химическая реакция, в которой амид функциональная группа в боковая цепь из аминокислоты аспарагин или же глутамин удаляется или превращается в другую функциональную группу. Обычно аспарагин превращается в аспарагиновая кислота или же изоаспарагиновая кислота. Глютамин превращается в глютаминовая кислота или же пироглутаминовая кислота (5-оксопролин). В белок или же пептид, эти реакции важны, потому что они могут изменить его структуру, стабильность или функцию и могут привести к деградации белка. Чистое химическое изменение - это добавление группы воды и удаление группы аммиака, что соответствует увеличению массы на +1 (0,98402) Да. Хотя дезамидирование происходит на глутамине, гликозилированном аспарагине и других амидах, они незначительны в типичных условиях протеолиза.[1]

При дезамидировании остатка аспарагина в физиологических условиях боковая цепь подвергается атаке атома азота следующей пептидной группы (черным цветом вверху справа на рисунке), образуя асимметричный сукцинимид средний (красным). Асимметрия интермедиата приводит к двум продуктам его гидролиза: либо аспарагиновая кислота (слева черным) или изоаспарагиновая кислота, что является бета-аминокислота (зеленым внизу справа). Однако есть опасения, что аспарагиновая кислота может быть изомеризована после дезамидирования.[2] Дезамидирование остатка глутамина может происходить по тому же механизму, но с гораздо более медленной скоростью, поскольку образование шестичленного кольца глютаримид промежуточное соединение менее предпочтительно, чем промежуточное соединение сукцинимида для аспарагина. В общем, дезамидирование можно устранить протеолизом при кислом или слабощелочном pH (4,5 и 8,0 соответственно) с использованием эндопротеазы Glu-C.[2]

Скорость дезамидирования зависит от множества факторов, включая первичные последовательности и структуры белков более высокого порядка, pH, температуру и компоненты в растворах. Большинство потенциальных центров дезамидирования стабилизированы структурой более высокого порядка. Asn-Gly (NG) является наиболее гибким и, поскольку он кислый, он наиболее склонен к дезамидированию с периодом полураспада около 24 часов в физиологических условиях (pH 7,4, 37 ° C).[3]

В качестве свободной аминокислоты или в качестве N-концевого остатка пептида или белка глутамин деамидат легко образует пироглутаминовая кислота (5-оксопролин). Реакция протекает через нуклеофильную атаку α-аминогруппы на амиде боковой цепи с образованием γ-лактама с отщеплением аммиака из боковой цепи.

Аналитический метод

Дезамидирование белков обычно анализируют с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (RPLC) посредством картирования пептидов. Недавно опубликованный новый метод ERLIC-MS / MS улучшит разделение деамидированных и недезамидированных пептидов с улучшенной идентификацией и количественной оценкой.[4]

Масс-спектрометрия обычно используется для характеристики состояний дезамидирования белков, включая терапевтические моноклональные антитела.[5] Этот метод особенно полезен для анализа дезамидирования из-за его высокой чувствительности, скорости и специфичности. Это позволяет проводить анализ дезамидирования на конкретном участке.[6]

Основной проблемой использования масс-спектрометрии является образование артефактов дезамидирования во время подготовки образца. Эти артефакты значительно искажают результаты, потому что они предполагают более высокую скорость спонтанного дезамидирования, чем то, что действительно наблюдается. Это может оказаться проблематичным в случае терапевтических белков, которые могут быть неправильно охарактеризованы в протоколах контроля качества, если большой процент детектируемого деамидирования вызван артефактами. Недавние исследования показывают, что более низкий pH может снизить скорость артефактов дезамидирования.[2]

Кинетика дезамидирования

Было высказано предположение, что реакции дезамидирования являются одним из факторов, ограничивающих полезное время жизни белков.[1]

Дезамидирование происходит намного быстрее, если за чувствительной аминокислотой следует небольшой гибкий остаток, такой как глицин чей низкий стерический помеха оставляет пептид группа открыта для атаки. Реакции дезамидирования также протекают намного быстрее при повышенном pH (> 10) и температура.

Эндопротеаза, Glu-C, показала специфичность только к глутаминовой кислоте в определенных условиях pH (4,5 и 8,0) и расщепляет C-концевую сторону в растворе с трис-HCl, бикарбонатом или ацетатом.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Кларк, S (2003). «Старение как война между химическими и биохимическими процессами: метилирование белков и признание поврежденных возрастом белков для восстановления». Старение Res Rev. 2: 263–285. Дои:10.1016 / S1568-1637 (03) 00011-4.
  2. ^ а б c Лю, Шаньшань; Моултон, Кевин Райан; Оклер, Джаред Роберт; Чжоу, Чжаохуэй Санни (2016-04-01). «Слабокислые условия устраняют артефакт деамидирования во время протеолиза: переваривание эндопротеазой Glu-C при pH 4,5». Аминокислоты. 48 (4): 1059–1067. Дои:10.1007 / s00726-015-2166-z. ISSN  1438-2199. ЧВК  4795971. PMID  26748652.
  3. ^ Tyler-Cross R, Schirch V (1991) Влияние аминокислотной последовательности, буферов и ионной силы на скорость и механизм дезамидирования остатков аспарагина в небольших пептидах. J Biol Chem266: 22549–22556
  4. ^ Чжэнь, Цзин (2018). «Характеристика антител с использованием нового пептидного картирования на основе ERLIC-MS / MS». mAbs. 10: 1–9. Дои:10.1080/19420862.2018.1505179. ЧВК  6204790. PMID  30130443.
  5. ^ Ван, Вэйцзе; Meeler, Andrea R .; Bergerud, Luke T .; Хессельберг, Марк; Бирн, Майкл; У, Чжучунь (2012). «Количественная оценка и характеристика дезамидирования антител путем картирования пептидов с масс-спектрометрией». Международный журнал масс-спектрометрии. 312: 107–113. Дои:10.1016 / j.ijms.2011.06.006.
  6. ^ Хао, Пилианг; Адав, Сунил С .; Галларт-Палау, Ксавьер; Сзе, Сиу Кван (ноябрь 2017 г.). «Последние достижения в масс-спектрометрическом анализе дезамидирования белков». Обзоры масс-спектрометрии. 36 (6): 677–692. Дои:10.1002 / mas.21491. ISSN  1098-2787. PMID  26763661.
  • Кларк, S (1987). «Склонность к спонтанному образованию сукцинимида из аспартильных и аспарагинильных остатков в клеточных белках». Int. J., Peptide Protein Res. 30: 808–821. PMID  3440704.
  • Stephenson, RC; Кларк, S (1989). «Образование сукцинимида из аспартил- и аспарагинилового пептидов как модель спонтанной деградации белков». J. Biol. Chem. 264: 6164–6170. PMID  2703484.
  • Робинсон NE, Робинсон AB. (2004) Молекулярные часы: дезамидирование аспарагиниловых и глутаминильных остатков в пептидах и белках. Althouse Press: Cave Junction, Ore. OCLC  56978028