Нокаутная крыса - Knockout rat

Нокаутная крыса

А нокаутирующая крыса это генно-инженерный крыса с одним ген выключен из-за целевой мутации (захват генов ) используется для академических и фармацевтических исследование. Нокаутные крысы могут имитировать человеческие болезни и являются важным инструментом для изучения функции генов (функциональная геномика ) и для открытие лекарств и развитие. Производство крыс с нокаутом было экономически или технически невозможно до 2008 года.[1][2][3][4]

Технология, разработанная за счет финансирования со стороны Национальные институты здоровья (NIH) и работа, проделанная членами Консорциума Knock Out Rat (KORC), привела к созданию экономически эффективных методов создания крыс-нокаутов. Важность разработки крысы как более универсального инструмента для исследований в области здоровья человека подтверждается инвестициями в 120 миллионов долларов, сделанными Национальным институтом здравоохранения через Консорциум проекта по секвенированию генома крыс, в результате чего был разработан черновой вариант последовательности лабораторного штамма коричневая или норвежская крыса (Раттус норвегикус).[5] Дополнительные разработки с нуклеаза цинкового пальца Технология в 2009 году привела к появлению первой крысы с целенаправленными мутациями, передаваемыми по зародышевой линии.[6] Нокаутные модели болезни крыс для Болезнь Паркинсона, Болезнь Альцгеймера, гипертония, и сахарный диабет с использованием технологии нуклеаз цинкового пальца коммерциализируется компанией SAGE Labs.[7][8]

Использование в исследованиях

Мыши, крысы и люди имеют все общие гены, кроме примерно 1%.[5][9][10] сделать грызунов хорошими модельными организмами для изучения функций генов человека. И мыши, и крысы относительно малы, просты в обращении, имеют короткое время генерации и являются генетически инбредными. Хотя мыши оказались полезной моделью грызунов, и были разработаны методы рутинного нарушения их генов, во многих случаях крысы считаются превосходными лабораторными животными для изучения и моделирования болезней человека.

Крысы физиологически более похожи на людей, чем мыши. Например, у крыс частота сердечных сокращений больше похожа на человеческую, а у мышей частота сердечных сокращений в пять-десять раз выше. Широко распространено мнение, что крыса - лучшая модель для человека, чем мышь. сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, артрит, и много аутоиммунный, неврологический расстройства поведения и зависимости.[11] Кроме того, модели крыс превосходят модели мышей для тестирования фармакодинамика и токсичность потенциальных терапевтических соединений, частично из-за того, что количество и тип многих из их детоксицирующих ферментов очень похожи на таковые у людей.[12] Их больший размер делает крыс более подходящими для изучения с помощью инструментов, а также облегчает такие манипуляции, как забор крови, нервную проводимость и выполнение операций.

На мышах доступны методы генетической манипуляции, которые обычно используются для моделирования болезней человека. Хотя опубликованных нокаутов существует примерно 60%[13] генов мышей, подавляющее большинство общих заболеваний человека не имеют нокаутирующая мышь модель. Нокаутные модели крыс являются альтернативой мышам, которые могут способствовать созданию новых генных нарушений, недоступных у мыши. Нокаутные модели крыс также могут дополнять существующие модели трансгенных мышей. Сравнение мутантов мыши и крысы может облегчить различие между специфическими для грызунов и общими млекопитающее фенотипы.

Проблемы производства

Модели на крысах использовались для продвижения многих областей медицинских исследований, включая сердечно-сосудистые заболевания, психические расстройства (исследования поведенческого вмешательства и зависимости), нервная регенерация, сахарный диабет, трансплантация, аутоиммунные расстройства (ревматоидный артрит ), рак, и заживление ран и костей. Пока доработка крысы геном Последовательность предоставляет очень важную информацию о том, как эти заболевания связаны с функцией генов, требует эффективного метода создания нокаутных моделей крыс, в которых манипулируют конкретными геномными последовательностями. Большинство методов генетических манипуляций, включая случайный мутагенез с помощью генная ловушка (на основе ретровирусов и не на основе ретровирусов), нокаут / нокаут генов и условные мутации зависят от культивирования и манипуляций с эмбриональными стволовыми (ES) клетками.[14] ЭС клетки крысы были выделены только недавно, и не сообщалось о каких-либо демонстрациях модификации генов в них. Следовательно, многие методы генетической манипуляции, широко используемые на мышах, у крыс невозможны.

Ранние методы

До коммерческой разработки мобильных ДНК технологии в 2007 году и технологии нуклеаз с цинковыми пальцами в 2009 году, было только две технологии, которые можно было использовать для создания моделей болезней человека на крысах: клонирование и химический мутагенез с использованием N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ ). Хотя клонирование перенос ядра соматической клетки (SCNT) теоретически можно использовать для создания крыс со специфическими мутациями путем мутации соматических клеток, а затем, используя эти клетки для SCNT, этот подход не был успешно использован для создания крыс с нокаутом. Одна из проблем этой стратегии заключается в том, что SCNT крайне неэффективен. Успешность первой опубликованной попытки составила менее 1%.[15] Альтернативно, мутагенез ENU представляет собой обычную стратегию нокаута гена случайного мутагенеза у мышей, которая также может быть использована у крыс. Мутагенез ENU включает использование химического вещества, N-этил-N-нитрозомочевины (ENU), для создания единичных основных изменений в геноме. ENU передает свою этильную группу радикалам кислорода или азота в ДНК, что приводит к неправильному спариванию и замене пары оснований. Мутантные животные могут быть получены путем введения самцу мыши ENU и скрещивания с самкой дикого типа для получения мутантного потомства. Мутагенез ENU создает высокую частоту случайных мутаций, с изменением примерно одной пары оснований в любом данном гене каждые 200-700 гаметы.[16] Несмотря на его высокую мутагенность, физическое проникновение ENU ограничено, и только около 500 генов мутируют для каждого самца, и очень небольшое количество полных мутаций имеет наблюдаемый фенотип. Как правило, тысячи мутаций необходимо создать у одного животного, чтобы создать один новый фенотип.

Несмотря на недавние улучшения в технологии ENU,[17][18][19] картирование мутаций, ответственных за определенный фенотип, обычно сложно и требует много времени. Нейтральные мутации необходимо отделить от мутаций, вызывающих их причину, путем экстенсивного разведения. ЕНУ и методы клонирования просто неэффективны для создания и картирования нокаутов генов у крыс для создания новых моделей болезней человека. В 2007 году крупнейший на сегодняшний день проект мутагенеза ENU крыс, осуществляемый Медицинский колледж Висконсина смогла произвести только 9 нокаутных линий за пять лет при средней цене 200 000 долларов за каждую нокаутную линию. Хотя некоторые компании все еще придерживаются этой стратегии, Медицинский колледж Висконсина перешел на более эффективный и коммерчески жизнеспособный метод с использованием мобильной ДНК и технологии CompoZr ZFN.

Цинк-палец и нуклеазная технология TALE

Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) и Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN) - это сконструированные ДНК-связывающие белки, которые облегчают целевое редактирование генома, создавая двухцепочечные разрывы в ДНК в указанных пользователем местах. Двухцепочечные разрывы важны для сайт-специфического мутагенеза, поскольку они стимулируют естественные процессы репарации ДНК клетки, а именно гомологичную рекомбинацию и негомологичное соединение концов. Когда клетка использует негомологичный путь соединения концов для восстановления двухцепочечного разрыва, присущая им неточность восстановления часто приводит к точно нацеленным мутациям. Это приводит к появлению эмбрионов с целевым нокаутом гена.[6][20] Стандартные методы микроинъекции позволяют этой технологии получать крыс с нокаутом за 4–6 месяцев. Основное преимущество опосредованного ZFN и TALEN нокаута гена по сравнению с использованием мобильной ДНК состоит в том, что конкретный ген может быть уникальным и специфическим направлением для нокаута. Напротив, нокауты, сделанные с использованием технологии мобильной ДНК, являются случайными и поэтому вряд ли нацелены на интересующий ген.

Технология мобильной ДНК

Технология мобильной ДНК (прыгающего гена) использует ретротранспозоны и транспозоны для изготовления нокаутных моделей крыс. Эта платформенная технология отвечает всем критериям успешного подхода к нокауту генов у млекопитающих, позволяя случайный мутагенез непосредственно в стволовые клетки (сперма и ооциты ) модельных организмов млекопитающих, включая крыс. Используя эту технологию, гены разрушаются полностью и стабильно, нокаутируются с высокой частотой и случайным образом разрушаются по всему геному. Геномное расположение мутаций может быть легко отображено, создавая библиотеку нокаутных крыс для дальнейшего использования. После создания случайных нокаутных мутаций можно создавать более тонкие мутации, такие как условные мутации, путем скрещивания нокаутных линий с линиями крыс, экспрессирующих CRE-рекомбиназа специфическим для ткани образом. Нок-ины могут быть произведены путем замены кассет, опосредованной рекомбинацией.

копилка (PB) ДНК-транспозоны

копилка транспозонная технология

копилка (PB) ДНК-транспозоны мобилизация с помощью механизма «вырезать и вставить», посредством которого фермент транспозазы (PB транспозаза), кодируемый самим транспозоном, вырезает и повторно интегрирует транспозон в других участках генома. Транспозаза PB специфически распознает инвертированные концевые повторы PB (ITR), фланкирующие транспозон; он связывается с этими последовательностями и катализирует удаление транспозона. Затем PB интегрируется на сайтах TTAA[21] по всему геному относительно случайным образом. Для создания мутаций генных ловушек (или адаптированных для создания трансгенных животных) транспозаза доставляется в транс на одной плазмиде и котрансфицируется плазмидой, содержащей донорский транспозон, рекомбинантный транспозон, содержащий генную ловушку, фланкированную сайтами связывания для транспозаза (ITR). Транспозаза будет катализировать удаление транспозона из плазмиды и последующую интеграцию в геном. Интеграция в кодирующую область захватывает элементы, необходимые для экспрессии генной ловушки. PB обладает несколькими идеальными свойствами: (1) он преимущественно вставляется в гены (от 50 до 67% вставок поражает гены) (2) он не проявляет локального перескока (широко распространенный геномный охват) (3) он не чувствителен к ингибированию чрезмерной продукции, при котором повышенные уровни транспозазы вызывают снижение транспозиции 4) она чисто иссекается с донорского участка, не оставляя «следов», в отличие от Спящей красавицы.[22][23]

Транспозоны "Спящей красавицы"

Технология транспозонов "Спящей красавицы"

Транспозон спящей красавицы (SB) является производным надсемейства ДНК-транспозонов Tc1 / mariner, распространенных в геномах как позвоночных, так и беспозвоночных. Однако эндогенные транспозоны ДНК из этого семейства полностью неактивны в геномах позвоночных. Активный транспозон Tc1 / mariner, синтезированный из выравнивания неактивных транспозонов из подсемейства элементов лососевых, был «пробужден», чтобы сформировать транспозон, названный Спящей красавицей.[24] SB, как и другие транспозоны ДНК, мобилизует себя посредством механизма вырезания и вставки, посредством которого фермент транспозазы, кодируемый самим транспозоном, вырезает и повторно интегрирует транспозон в других участках генома. Белок SB из 340 аминокислот распознает инвертированные концевые повторы (ITR), фланкирующие транспозон; он связывается с этими последовательностями и катализирует удаление транспозона. Затем SB интегрируется в случайные участки генома, хотя некоторые исследования сообщают об очень незначительном предпочтении транскрипционных единиц.[25][26] Также существует простая потребность в ТА-динуклеотиде в целевом сайте, как и во всех транспозонах Tc1 / mariner.[27]

Транспозон SB является мощным инструментом инсерционного мутагенеза у многих видов позвоночных. Недавно он показал особую полезность для мутагенеза зародышевой линии как у мышей, так и у крыс.[28][29][30][31][32][33][34] Есть несколько преимуществ, которые делают SB очень привлекательным мутагеном, направленным на открытие генов: 1) он имеет небольшую предвзятость для вставки в определенные области генома или в определенные последовательности распознавания, 2) вставки транспозона de novo обеспечивают «меченый» маркер последовательности для быстрая идентификация специфической мутации с помощью простых методов клонирования ПЦР; 3) инсерционный мутагенез SB in vivo позволяет быстро и легко генерировать множественные мутации у одного животного и в одной ткани, такой как аденоматозный полип.

Ретротранспозоны LINE1 (L1)

Технология ретротранспозона L1

Транспозоны и ретротранспозоны являются ценными инструментами для беспристрастного открытия генов в качестве мобильных фрагментов ДНК, используемых для разрушения генов. Ретротранспозоны, такие как LINE (длинные вкрапленные ядерные элементы), мобилизуются посредством механизма «копировать и вставлять» и широко распространены у многих видов эукариот. Несколько ретротранспозонов L1 остались активными у мышей и людей. L1 содержат небольшой внутренний промотор в 5’-нетранслируемой области для управления экспрессией, два открытые рамки для чтения (ORF) и 3’-нетранслируемую область, содержащую последовательности для полиаденилирования. Две ORF кодируют белки, необходимые для автономной ретротранспозиции; ORF1 кодирует РНК -связывающий белок, в то время как ORF2 кодирует белок, содержащий активность эндонуклеазы (EN) и обратной транскриптазы (RT), который разрывает сайт в ДНК, а затем создает копию посредством RT. Эти белки демонстрируют подавляющую специфичность связывания с кодирующим их транскриптом и воздействия на него, что позволяет практически исключить мобилизацию родительской РНК L1. Используя RT-активность белка ORF2, транскрибируемая РНК L1 копируется в ДНК с помощью процесса, называемого обратной транскрипцией с примированием мишени (TPRT),[35] и интегрирован в геном. Интеграция происходит с небольшим смещением для любой конкретной области генома, требуя простой консенсусной последовательности 5’TTT’A-3 ’(вместе с небольшими вариациями этой последовательности). Интегрированные последовательности L1 часто усекаются на 5’-конце, средний общий размер которых составляет 1 Кб, многие из них содержат только 3’-концевые последовательности.

Природа ретротранспозиции наделяет L1 некоторыми уникальными преимуществами; Ретротранспозоны L1 имеют по существу неограниченный запас инсерционного мутагена, поскольку он постоянно транскрибируется с промотора, что может быть полезно для приложений, где требуется большое количество мутаций в одной клетке. Элементы L1 также демонстрируют широкое распространение генома с в значительной степени случайным распределением вставок.[36][37][38] Вставки L1 в сайты генома также необратимы, и, таким образом, любое мутагенное событие, вызванное вставкой L1, «помечается» последовательностями L1.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Эбботт A: Лабораторные животные: крыса эпохи Возрождения. Nature 2004, 428: 464-466.
  2. ^ Zhou Q, Renard JP, Le Friec G, Brochard V, Beaujean N, Cherifi Y, Fraichard A, Cozzi J: Создание фертильных клонированных крыс путем регулирования активации ооцитов. Наука 2003, 302: 1179.
  3. ^ Джастис MJ, Noveroske JK, Weber JS, Zheng B, Bradley A: Мутагенез ENU мышей. Hum Mol Genet 1999, 8: 1955–1963.
  4. ^ Китада К., Ишишита С., Тосака К., Такахаши Р., Уэда М., Кенг В.В., Хори К., Такеда Дж.: Мутагенез с меткой транспозона у крысы. Нат Методы 2007, 4: 131-133.
  5. ^ а б Консорциум проекта по секвенированию генома крысы, последовательность генома коричневой крысы дает представление об эволюции млекопитающих. Nature, 2004. 428 (6982): с. 493-521.
  6. ^ а б Guerts, A.M., et. и др. Крысы с нокаутом посредством микроинъекции в эмбрион нуклеаз цинковых пальцев. Наука. Том 325: 433 (24 июля, 2009 г.) Geurts, A. M .; Стоимость, Г. Дж .; Freyvert, Y .; Zeitler, B .; Miller, J.C .; Чой, В. М .; Jenkins, S. S .; Wood, A .; Cui, X .; Meng, X .; Винсент, А .; Lam, S .; Michalkiewicz, M .; Schilling, R .; Foeckler, J .; Kalloway, S .; Weiler, H .; Menoret, S .; Anegon, I .; Дэвис, Г. Д .; Zhang, L .; Rebar, E.J .; Gregory, P.D .; Урнов, Ф. Д .; Jacob, H.J .; Бюлоу, Р. (2009). «Нокаут-крысы с помощью микроинъекции в эмбрионы нуклеаз цинка на пальцах». Наука. 325 (5939): 433–433. Дои:10.1126 / science.1172447. ЧВК  2831805. PMID  19628861.
  7. ^ Вецек, Андрей. «Год крысы», Биотехнологии, 2009-10-01.
  8. ^ «Сигма-Олдрич разрабатывает модели болезни Паркинсона» В архиве 2009-10-08 на Wayback Machine, LaboratoryTalk
  9. ^ Международный консорциум по секвенированию генома человека, Первоначальное секвенирование и анализ генома человека. Nature, 2001. 409 (6822): с. 860-921.
  10. ^ Консорциум по секвенированию генома мышей, начальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши. Nature, 2002. 420 (6915): с. 520-62.
  11. ^ Эбботт А. Лабораторные животные: крыса эпохи Возрождения. Nature, 2004. 428 (6982): с. 464-6.
  12. ^ Линдблад-То, К., Секвенирование генома: компания троих. Nature, 2004. 428 (6982): с. 475-6.
  13. ^ Замбрович, 1998; Скарнес и др., 2004; To et al., 2004; Nord et al., 2006
  14. ^ Коэн-Таннуджи, М. и К. Бабине, Помимо «нокаутных» мышей: новые перспективы для программируемой модификации генома млекопитающих. Molecular Human Reproduction, 1998. 4 (10): p. 929-38.
  15. ^ Чжоу, Q., J.P. Renard, G. Le Friec, V. Brochard, N. Beaujean, Y. Cherifi, A. Fraichard и J. Cozzi, Создание фертильных клонированных крыс путем регулирования активации ооцитов. Science, 2003. 302 (5648): с. 1179.
  16. ^ Хитоцумачи, С., Д.А. Карпентер и У. Рассел, Повторение дозы увеличивает мутагенную эффективность N-этил-N-нитрозомочевины при сперматогониях мышей. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985. 82 (19): p. 6619-21.
  17. ^ Браун, С. и Р.Э. Hardisty, Стратегии мутагенеза для выявления новых локусов, связанных с фенотипами заболеваний. Семинары по клеточной биологии и биологии развития, 2003. 14 (1): p. 19-24.
  18. ^ Чен, Ю., Д. Йи, К. Дайнс, А. Чаттерджи, Дж. Кавалколи, Э. Шнайдер, Дж. Ом, Р. П. Войчик и Т. Магнусон, Скрининг на основе генотипа для вызванных ENU мутаций в эмбриональном стволе мыши клетки. Nature Genetics, 2000. 24 (3): с. 314-7.
  19. ^ Зан, Ю., Дж.Д. Хааг, К.С. Чен, Л.А. Шепел, Д. Вигингтон, Ю.Р. Ван, Р. Ху, К.С. Лопес-Гуахардо, Х.Л. Брозе, К.И. Портер, Р.А. Леонард, А.А. Hitt, S.L. Шоммер, А.Ф. Элегбеде, М. Гулд, Получение нокаутных крыс с использованием мутагенеза ENU и дрожжевого скринингового анализа. Nature Biotechnology, 2003. 21 (6): с. 645-51.
  20. ^ Тессон и др., Крысы-нокауты, полученные путем микроинъекции эмбрионов TALEN. Nature Biotechnology Vol 29: 695-96 (5 августа 2011 г.) Tesson, L .; Usal, C .; Ménoret, S. V .; Leung, E .; Niles, B.J .; Реми, С. В .; Santiago, Y .; Винсент, А. И .; Meng, X .; Zhang, L .; Gregory, P.D .; Anegon, I .; Стоимость, Г. Дж. (2011). «Нокаутные крысы, полученные в результате микроинъекции эмбрионов TALEN». Природа Биотехнологии. 29 (8): 695–696. Дои:10.1038 / nbt.1940. PMID  21822240.
  21. ^ Фрейзер, М.Дж. и др., Точное удаление ТТАА-специфичных транспозонов чешуекрылых piggyBac (IFP2) и тагалонга (TFP3) из генома бакуловируса в клеточных линиях двух видов Lepidoptera. Insect Mol Biol, 1996. 5 (2): с. 141-51.
  22. ^ Митра Р., Дж. Файн-Торнтон и Н.Л. Крейг, piggyBac может обходить синтез ДНК во время копирования и вставки. EMBO J, 2008.
  23. ^ Динг, С. и др., Эффективная транспозиция транспозона piggyBac (PB) в клетки млекопитающих и мышей. Cell, 2005. 122 (3): p. 473-83.
  24. ^ Ivics, Z., et al., Молекулярная реконструкция Спящей красавицы, Tc1-подобного транспозона из рыб, и его транспозиция в человеческих клетках. Cell, 1997. 91 (4): p. 501-10.
  25. ^ Вигдал Т.Дж. и др., Общие физические свойства ДНК, влияющие на выбор целевого участка спящей красавицы и других мобильных элементов Tc1 / mariner. J Mol Biol, 2002. 323 (3): p. 441-52.
  26. ^ Янт С.Р. и др., Полное геномное картирование интеграции транспозонов у млекопитающих с высоким разрешением. Mol Cell Biol, 2005. 25 (6): стр. 2085-94.
  27. ^ Пластерк Р.Х., Изсвак З., Ивиц З., Инопланетяне-резиденты: суперсемейство мобильных элементов Tc1 / mariner. Trends Genet, 1999. 15 (8): p. 326-32.
  28. ^ Geurts, A.M., et al., Мутации генов и геномные перестройки у мышей в результате мобилизации транспозонов из хромосомных конкатемеров. PLoS Genet, 2006. 2 (9): с. e156.
  29. ^ Хори К. и др., Характеристика транспозиции «Спящая красавица» и ее применение для генетического скрининга мышей. Mol Cell Biol, 2003. 23 (24): стр. 9189-207.
  30. ^ Keng, V.W., et al., Регион-специфический мутагенез зародышевой линии насыщения у мышей с использованием системы транспозонов Sleeping Beauty. Nat Methods, 2005. 2 (10): с. 763-9.
  31. ^ Kitada, K., et al., Транспозон-меченный мутагенез у крыс. Nat Methods, 2007. 4 (2): с. 131-3.
  32. ^ Geurts, A.M., et al., Условная экспрессия генов у мышей с использованием транспозона-ловушки для генов Sleeping Beauty. BMC Biotechnol, 2006. 6: с. 30.
  33. ^ Дюпюи, А.Дж., С. Фриц, Д.А. Largaespada, Транспозиция и нарушение гена в мужской зародышевой линии мыши. Бытие, 2001. 30 (2): с. 82-8.
  34. ^ Dupuy, A.J., et al., Трансгенез зародышевой линии млекопитающих путем транспозиции. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99 (7): p. 4495-9.
  35. ^ Луан, Д. Д., М. Х. Корман, Я.Л. Якубчак, Т. Эйкбуш, обратная транскрипция РНК R2Bm праймирована разрывом в хромосомном сайте-мишени: механизм ретротранспозиции не-LTR. Cell, 1993. 72 (4): p. 595-605.
  36. ^ Ostertag, E.M., et al., Модель ретротранспозиции L1 человека на мышах. Nat Genet, 2002. 32 (4): p. 655-60.
  37. ^ Бабушок Д.В. и др., Интеграция L1 в модели трансгенных мышей. Genome Res, 2006. 16 (2): p. 240-50.
  38. ^ Стоимость, G.J. и J.D. Boeke, Нацеливание на интеграцию ретротранспозона человека определяется специфичностью эндонуклеазы L1 в отношении участков с необычной структурой ДНК. Биохимия, 1998. 37 (51): с. 18081-93.

внешняя ссылка