Нацеливание на гены - Gene targeting

А химерный ген мыши, нацеленный на ген окраса шерсти агути, со своим потомством

Нацеливание на гены (также, стратегия замены, основанная на гомологичной рекомбинации) это генетический техника, которая использует гомологичная рекомбинация изменить эндогенный ген. Метод может использоваться для удаления гена, удаления экзоны, добавить ген и изменить отдельные пары оснований (ввести точечные мутации ). Нацеливание на гены может быть постоянным или условным. Условия могут быть определенным временем в течение развитие / жизнь организма или ограничение конкретным ткань, Например. Нацеливание на гены требует создания специфических вектор для каждого интересующего гена. Однако его можно использовать для любого гена, независимо от транскрипционной активности или размера гена.

Методы

В общем, ДНК содержащий часть целевого гена, репортерный ген, а (доминирующий) выбираемый маркер собран в бактерии.

Методы нацеливания на гены созданы для нескольких модельные организмы и может отличаться в зависимости от виды используемый. Чтобы нацелить гены в мышей, ДНК вставляется в мышь эмбриональные стволовые клетки в культуре. Клетки со вставкой могут вносить вклад в ткань мыши через эмбрион инъекция. В заключение, химерный мыши, у которых модифицированные клетки составляют репродуктивные органы, разводят. После этого шага все тело мыши основано на выбранных эмбриональных стволовых клетках.

Дикого типа Физкомитрелла и нокаут-мхи: Отклоняющиеся фенотипы, индуцированные в трансформантах библиотеки с нарушением генов. Физкомитрелла дикого типа и трансформированные растения выращивали на минимальной среде Кнопа для индукции дифференцировки и развития гаметофоры. Для каждого завода отображается обзор (верхний ряд, масштабная полоса соответствует 1 мм) и крупный план (нижний ряд, масштабная полоса равна 0,5 мм). A, гаплоидный мох дикого типа, полностью покрытый лиственными гаметофорами, и крупный план листа дикого типа. Б-Д, Разные мутанты.[1]

Чтобы нацелить гены в мох, ДНК инкубируют вместе со свежевыделенными протопласты и с полиэтиленгликоль. Как мхи гаплоидный организмы[2] мох волокна (протонема ) могут быть непосредственно скринированы на предмет наличия мишени, либо путем обработки антибиотики или с ПЦР. Уникальный среди растения, эта процедура для обратная генетика так же эффективен, как в дрожжи.[3] Нацеливание на гены успешно применялось к крупному рогатому скоту, овцам, свиньям и многим грибам.

Частота нацеливания на гены может быть значительно увеличена за счет использования инженерных эндонуклеазы такие как нуклеазы цинковых пальцев,[4] спроектированный самонаводящиеся эндонуклеазы,[5] и нуклеазы на основе инженерных TAL эффекторы.[6] Этот метод был применен к видам, включая Drosophila melanogaster,[4] табак,[7][8] кукуруза,[9] человек клетки[10] мышей[11] и крысы.[11]

Сравнение с улавливанием генов

Захват генов основан на случайной вставке кассеты, в то время как нацеливание на ген манипулирует конкретным геном. Кассеты можно использовать для множества разных целей, в то время как фланкирующие области гомологии кассет нацеливания на гены должны быть адаптированы для каждого гена. Это делает генную ловушку более удобной для крупномасштабных проектов, чем таргетинг. С другой стороны, нацеливание на гены можно использовать для генов с низкой транскрипцией, которые не будут обнаружены при скрининге ловушек. Вероятность захвата увеличивается с увеличением интрон размер, в то время как для нацеливания на гены небольшие гены также легко изменяются.

Приложения

Нацеливание на гены широко используется для изучения генетических заболеваний человека путем удаления ("выбивание ") или добавление (" вбивание ") конкретных представляющих интерес мутаций.[12] Достижения в технологиях нацеливания на гены, которые ранее использовались для разработки моделей крысиновых клеток, позволили создать новую волну модели изогенных болезней человека. Эти модели самые точные in vitro доступные исследователям модели и способствуют разработке персонализированных лекарств и диагностических средств, особенно в онкология.[13]

Нобелевская премия 2007 г.

Марио Р. Капеччи, Мартин Дж. Эванс и Оливер Смитис были награждены 2007 Нобелевская премия по физиологии и медицине за их работу над «принципами введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток» или нацеливания на гены.[14]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Egener, T .; Гранадо, Дж .; Guitton, M.C .; Hohe, A .; Holtorf, H .; Lucht, J.M .; Ренсинг, С. А .; Schlink, K .; Schulte, J .; Schween, G .; Zimmermann, S .; Duwenig, E .; Рак, Б .; Рески, Р. (2002). «Высокая частота фенотипических отклонений у растений Physcomitrella patens, трансформированных библиотекой генных нарушений». BMC Биология растений. 2: 6. Дои:10.1186/1471-2229-2-6. ЧВК  117800. PMID  12123528.
  2. ^ Ральф Рески (1998): Развитие,генетика и молекулярная биология из мхи. Botanica Acta 111, 1-15.
  3. ^ Ральф Рески (1998): Физкомитрелла и Арабидопсис: Давид и Голиаф обратная генетика. Тенденции растений в науке 3, 209-210. [1]
  4. ^ а б Бибикова, М .; Beumer, K .; Trautman, J .; Кэрролл, Д. (2003). «Улучшение нацеливания на гены с помощью разработанных нуклеаз цинковых пальцев». Наука. 300 (5620): 764. Дои:10.1126 / science.1079512. PMID  12730594. S2CID  42087531.
  5. ^ Grizot, S .; Smith, J .; Daboussi, F .; Prieto, J .; Redondo, P .; Merino, N .; Villate, M .; Thomas, S .; Lemaire, L .; Montoya, G .; Blanco, F.J .; Pâques, F .; Дюшато, П. (2009). «Эффективное нацеливание гена SCID с помощью сконструированной одноцепочечной эндонуклеазы самонаведения». Исследования нуклеиновых кислот. 37 (16): 5405–5419. Дои:10.1093 / нар / gkp548. ЧВК  2760784. PMID  19584299.
  6. ^ Miller, J.C .; Tan, S .; Qiao, G .; Barlow, K. A .; Wang, J .; Xia, D. F .; Meng, X .; Paschon, D. E .; Leung, E .; Hinkley, S.J .; Dulay, G.P .; Hua, K. L .; Анкудинова, И .; Стоимость, Г. Дж .; Урнов, Ф. Д .; Zhang, H. S .; Holmes, M.C .; Zhang, L .; Gregory, P.D .; Ребар, Э. Дж. (2010). «СКАЗКА об архитектуре нуклеазы для эффективного редактирования генома». Природа Биотехнологии. 29 (2): 143–148. Дои:10.1038 / nbt.1755. PMID  21179091. S2CID  53549397.
  7. ^ Cai, C.Q .; Дойон, Й ​​.; Ainley, W. M .; Miller, J.C .; Dekelver, R.C .; Moehle, E. A .; Rock, J.M .; Lee, Y. L .; Гарнизон, р .; Schulenberg, L .; Blue, R .; Worden, A .; Бейкер, Л .; Faraji, F .; Zhang, L .; Holmes, M.C .; Rebar, E.J .; Collingwood, T. N .; Рубин-Уилсон, Б .; Gregory, P.D .; Урнов, Ф. Д .; Петолино, Дж. Ф. (2008). «Нацеленная интеграция трансгена в растительные клетки с использованием разработанных нуклеаз цинковых пальцев». Молекулярная биология растений. 69 (6): 699–709. Дои:10.1007 / s11103-008-9449-7. ISSN  0167-4412. PMID  19112554.
  8. ^ Townsend, J. A .; Райт, Д. А .; Уинфри, Р. Дж .; Fu, F .; Maeder, M. L .; Joung, J. K .; Войтас, Д. Ф. (2009). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа. 459 (7245): 442–445. Bibcode:2009Натура.459..442Т. Дои:10.1038 / природа07845. ЧВК  2743854. PMID  19404258.
  9. ^ Шукла, В. К .; Дойон, Й ​​.; Miller, J.C .; Dekelver, R.C .; Moehle, E. A .; Worden, S.E .; Mitchell, J.C .; Arnold, N.L .; Gopalan, S .; Meng, X .; Чой, В. М .; Rock, J.M .; Wu, Y. Y .; Katibah, G.E .; Чжифанг, G .; McCaskill, D .; Симпсон, М. А .; Blakeslee, B .; Greenwalt, S.A .; Батлер, Х. Дж .; Hinkley, S.J .; Zhang, L .; Rebar, E.J .; Gregory, P.D .; Урнов, Ф. Д. (2009). «Точная модификация генома сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа. 459 (7245): 437–441. Bibcode:2009Натура.459..437S. Дои:10.1038 / природа07992. PMID  19404259.
  10. ^ Урнов, Ф. Д .; Miller, J.C .; Lee, Y. L .; Beausejour, C.M .; Rock, J.M .; Август, S .; Jamieson, A.C .; Porteus, M. H .; Gregory, P.D .; Холмс, М. К. (2005). «Высокоэффективная эндогенная коррекция генов человека с использованием разработанных нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа. 435 (7042): 646–651. Bibcode:2005Натура.435..646U. Дои:10.1038 / природа03556. PMID  15806097.
  11. ^ а б Cui, X .; Ji, D .; Фишер, Д. А .; Wu, Y .; Бринер, Д. М .; Вайнштейн, Э. Дж. (2010). «Целенаправленная интеграция в эмбрионы крысы и мыши с нуклеазами цинкового пальца». Природа Биотехнологии. 29 (1): 64–7. Дои:10.1038 / nbt.1731. PMID  21151125.
  12. ^ Фанелли, Алекс (2017). «Применение ксенотрансплантата». Xenograft.net. Получено 15 января 2018.
  13. ^ Сур, Суроджит; Пальярини, Раймонд; Бунц, Фред; Раго, Карло; Диас, Луис А .; Kinzler, Kenneth W .; Фогельштейн, Берт; Пападопулос, Николас (10 марта 2009 г.). «Панель изогенных раковых клеток человека предлагает терапевтический подход к лечению рака с помощью инактивированного p53». Труды Национальной академии наук. 106 (10): 3964–3969. Bibcode:2009ПНАС..106.3964С. Дои:10.1073 / pnas.0813333106. ЧВК  2656188. PMID  19225112.
  14. ^ "Пресс-релиз: Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007 г.". Получено 2007-10-08.
  15. ^ Нокаут гена арабидопсиса: требуются фенотипы

внешние ссылки