НаноЗАЖИМ - nanoCLAMP - Wikipedia

В медицинской сфере иммунология, наноЗАЖИМ (CLостридальный Аничто Mиметик пroteins) аффинные реагенты рекомбинантные 15 кДа миметик антител белки, отобранные для плотного, селективного и мягко обратимого связывания с молекулами-мишенями.[1] Каркас nanoCLAMP основан на IgG-подобном термостабильном семейство модулей связывания углеводов 32 (CBM32) из Clostridium perfringens гиалуронидаза (токсин Mu). Форма nanoCLAMP приближается к цилиндру длиной приблизительно 4 нм и диаметром 2,5 нм, примерно такого же размера, как у цилиндра. нанотело (PDB: 2W1Q). nanoCLAMPs для конкретных целей генерируются путем изменения аминокислота последовательности, а иногда и длину трех экспонируемых растворителем соседних петель, которые соединяют бета-цепи, составляющие бета-сэндвич-складку, обеспечивая аффинность связывания и специфичность для мишени.[1]

Характеристики

nanoCLAMP - это первые миметики антител описанный как полиол -отзывчивый,[2] это означает, что они освобождают свои цели при воздействии нехаотропный соль и полиол, Такие как пропиленгликоль.[1][3] Было показано, что это свойство полезно для очистки функциональных белков и белковые комплексы к аффинная очистка. nanoCLAMPs легко производятся в цитоплазма из Кишечная палочка, с типичной урожайностью в диапазоне от 50 до 300 мг / л культуры. Поскольку в nanoCLAMP отсутствуют цистеины, сконструированный C-концевой цистеин можно использовать для сайт-направленной конъюгации таких объектов, как флуорофоры или смолы с использованием тиол -химия.

Разработка и приложения

nanoCLAMP были разработаны в лабораториях Nectagen, Inc. nanoCLAMP фаговый дисплей были сконструированы библиотеки, вариабилизирующие 16 открытых поверхностей. аминокислоты в три контура с функциональным разнообразием примерно 109 варианты. Эти библиотеки были проверены на наличие связующих для целевой белки и пептиды, обычно давая от 1 до 30 уникальных связующих веществ для мишени.[1]

Очищенные nanoCLAMP, содержащие один C-концевой цистеин, могут быть легко конъюгированы с галоацетил-активированным агароза смолы в нативных или денатурирующих условиях, и полученные тиоэфир Связка делает смолы стойкими к выщелачиванию. Мишени могут быть очищены до очевидной гомогенности за один этап. В полиол -отзывчивый[2] природа смол позволяет мишеням быть элюированный с 0,75 М сульфат аммония и 40% пропиленгликоль в pH 7.9, условия, которые показали сохранение естественной структуры и белковые комплексы.[1][3][4][5][6]

nanoCLAMP были произведены для зеленый флуоресцентный белок (GFP), мЧерри, СУМО (SMT3), NusA, авидин, NeutrAvidin, мальтозо-связывающий белок (MBP), тиоредоксин 1, бета-галактозидаза, SlyD и другие. Типичная связывающая способность смол составляет от 1 до 4 мг / мл смолы. Поскольку nanoCLAMP легко складываются, смолы nanoCLAMP можно регенерировать несколько раз, используя гуанидин хлорид для очистки смолы.[1]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж Судерман Р.Дж., Райс Д.А., Гибсон С.Д., Стрик Э.Дж., Чао Д.М. (17 апреля 2017 г.). «Разработка полиол-чувствительных миметиков антител для одностадийной очистки белка». Экспрессия и очистка белков. 134: 114–124. Дои:10.1016 / j.pep.2017.04.008. PMID  28428153.
  2. ^ а б Берджесс Р. Р., Уотсон Дж. Д. (июнь 2017 г.). «Нежная аффинная хроматография с миметиками антител с полиол-чувствительными nanoCLAMP». Экспрессия и очистка белков. 134: 154–155. Дои:10.1016 / j.pep.2017.06.002.
  3. ^ а б Томпсон Н. Э., Аронсон Д. Б., Берджесс Р. Р. (1990). «Очистка эукариотической РНК-полимеразы II с помощью иммуноаффинной хроматографии. Элюирование активного фермента с помощью стабилизаторов белка из полиол-чувствительного моноклонального антитела». J Biol Chem. 265: 7069–7077. PMID  2324114.
  4. ^ Томпсон Н. Э., Фоли К. М., Сталдер Е. С., Берджесс Р. Р. (2009). «Идентификация, производство и использование полиол-чувствительных моноклональных антител для иммуноаффинной хроматографии». Методы Энзимол. 463: 475–494. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63028-7. PMID  19892188.
  5. ^ Томпсон Н. Э., Хагер Д. А., Берджесс Р. Р. (4 августа 1992 г.). «Выделение и характеристика полиол-чувствительного моноклонального антитела, полезного для бережной очистки РНК-полимеразы Escherichia coli». Биохимия. 31: 7003–7008. Дои:10.1021 / bi00145a019. PMID  1637835.
  6. ^ Томпсон Н. Е., Дженсен Д. Б., Ламберски Дж. А., Берджесс Р. Р. (2006). «Очистка белковых комплексов с помощью иммуноаффинной хроматографии: приложение к аппарату транскрипции». Genet Eng (N Y). 27: 81–100. PMID  16382873.

внешняя ссылка