Равновесие разворачивается - Equilibrium unfolding

В биохимия, установление равновесия это процесс разворачивание молекулы белка или РНК путем постепенного изменения окружающей среды, например, путем изменения температуры или давления, добавления химических денатурирующих веществ или приложения силы, как в случае атомно-силовой микроскоп кончик. Поскольку равновесие сохраняется на всех этапах, процесс обратим (равновесное складывание). Равновесное разворачивание используется для определения конформационной стабильности молекулы.

Теоретические основы

В своей простейшей форме равновесное развертывание предполагает, что молекула может принадлежать только двум термодинамическим состояниям: сложенное состояние (обычно обозначается N для «родного» состояния) и в развернутом состоянии (обычно обозначается U). Эта модель сворачивания белков "все или ничего" была впервые предложена Тим Энсон в 1945 г.^[1] но считается, что это справедливо только для небольших, одиночных структурные области белков (Джексон, 1998); более крупные домены и многодоменные белки часто имеют промежуточные состояния. Как обычно в статистическая механика эти состояния соответствуют ансамбли молекулярных конформаций, а не только одной конформации.

Молекула может переходить между нативным и развернутым состояниями согласно простой кинетической модели.

N ⇌ U

с константы скорости ${displaystyle k_{f}}$ и ${displaystyle k_{u}}$ для складывания (${displaystyle {ce {U -> N}}}$) и разворачивая (${displaystyle {ce {N -> U}}}$) реакции соответственно. Безразмерный константа равновесия ${displaystyle K_{eq} {stackrel {mathrm {def} }{=}} {frac {k_{u}}{k_{f}}}={frac {left[{ce {U}}ight]_{eq}}{left[{ce {N}}ight]_{eq}}}}$ может использоваться для определения конформационной стабильности ${displaystyle Delta G^{o}}$ по уравнению

${displaystyle Delta G^{o}=-RTln K_{eq}}$

куда ${displaystyle R}$ это газовая постоянная и ${displaystyle T}$ это абсолютная температура в кельвин. Таким образом, ${displaystyle Delta G^{o}}$ положительно, если развернутое состояние менее стабильно (т. е. неблагоприятно) по сравнению с исходным состоянием.

Самый прямой способ измерения конформационной стабильности ${displaystyle Delta G^{o}}$ молекулы с двухуровневым сворачиванием заключается в измерении ее кинетических констант скорости ${displaystyle k_{f}}$ и ${displaystyle k_{u}}$ в интересующих условиях решения. Однако, поскольку сворачивание белка обычно завершается за миллисекунды, такие измерения могут быть трудными для выполнения, обычно требуя больших затрат. остановился поток или (совсем недавно) смесители непрерывного действия спровоцировать сворачивание с высоким временным разрешением. Двойная поляризационная интерферометрия это новый метод прямого измерения конформационное изменение и ${displaystyle Delta G^{o}}$.

Химическая денатурация

В менее обширной технике установление равновесия, доли свернутых и развернутых молекул (обозначены как ${displaystyle p_{N}}$ и ${displaystyle p_{U}}$соответственно) измеряются по мере постепенного изменения условий решения от тех, которые благоприятствуют естественному состоянию, к условиям, благоприятствующим развернутому состоянию, например, путем добавления денатурирующий агент Такие как гуанидиния гидрохлорид или же мочевина. (В равновесное складывание, выполняется обратный процесс.) Учитывая, что суммы долей должны быть равны единице, а их соотношение должно быть выражено Фактор Больцмана, у нас есть

${displaystyle p_{N}={frac {1}{1+e^{-Delta G/RT}}}}$

${displaystyle p_{U}=1-p_{N}={frac {e^{-Delta G/RT}}{1+e^{-Delta G/RT}}}={frac {1}{1+e^{Delta G/RT}}}}$

Обычно обнаруживается, что стабильность белков линейно зависит от концентрации денатуранта. Для объяснения этого наблюдения был предложен ряд моделей, среди которых выделяется модель связывания денатуранта, модель обмена растворителя (оба Джона Шеллмана^[2]) и Модель линейной экстраполяции (LEM; Ник Пейс^[3]). Все модели предполагают, что только два термодинамических состояния заселяются / исчезают при денатурации. Их можно расширить для интерпретации более сложных схем реакций.

В модель связывания денатуранта предполагает, что в белковой молекуле есть специфические, но независимые участки (свернутые или развернутые), с которыми денатурирующий агент связывается с эффективной (средней) константой связывания k. Равновесие смещается в сторону развернутого состояния при высоких концентрациях денатуранта, поскольку у него больше сайтов связывания денатуранта по сравнению с свернутым состоянием (${displaystyle Delta n}$). Другими словами, увеличение числа потенциальных сайтов, экспонируемых в развернутом состоянии, рассматривается как причина денатурационных переходов. При элементарном лечении возникает следующая функциональная форма:

${displaystyle Delta G=Delta G_{w}-RTDelta nln left(1+k[D]ight)}$

куда ${displaystyle Delta G_{w}}$ - стабильность белка в воде, а [D] - концентрация денатуранта. Таким образом, для анализа данных денатурации с помощью этой модели требуется 7 параметров: ${displaystyle Delta G_{w}}$,${displaystyle Delta n}$, k, а также наклоны и пересечения базовых линий сложенного и развернутого состояний.

В модель обмена растворителя (также называемая «моделью слабого связывания» или «селективной сольватацией») Шеллмана обращается к идее равновесия между молекулами воды, связанными с независимыми участками белка, и молекулами денатуранта в растворе. Он имеет вид:

${displaystyle Delta G=Delta G_{w}-RTDelta nln left(1+(K-1)X_{D}ight)}$

куда ${displaystyle K}$ - константа равновесия обменной реакции и ${displaystyle X_{d}}$ - мольная доля денатурирующего агента в растворе. Эта модель пытается ответить на вопрос, действительно ли молекулы денатуранта связываются с белком или они казаться быть связанным только потому, что денатурирующие вещества занимают около 20-30% от общего объема раствора при высоких концентрациях, используемых в экспериментах, т.е. неспецифических эффектах - отсюда и термин «слабое связывание». Как и в модели связывания денатуранта, соответствие этой модели также требует 7 параметров. Одна общая идея, полученная из обеих этих моделей, заключается в том, что константы связывания (в молярной шкале) для мочевины и гидрохлорида гуанидиния невелики: ~ 0,2 ${displaystyle M^{-1}}$ для мочевины и 0,6 ${displaystyle M^{-1}}$ для GuHCl.

Интуитивно понятно, что разница в количестве участков связывания между свернутым и развернутым состояниями прямо пропорциональна различиям в доступной площади поверхности. Это составляет основу LEM что предполагает простую линейную зависимость стабильности от концентрации денатуранта. Результирующий наклон графика зависимости стабильности от концентрации денатуранта называется m-значением. В чисто математических терминах величина m является производной от изменения свободной энергии стабилизации при добавлении денатурирующего вещества. Тем не менее, сильная корреляция между доступной площадью поверхности (ASA), экспонируемой при разворачивании, то есть разницей в ASA между развернутым и свернутым состояниями исследуемого белка (dASA), и значением m была задокументирована Пейсом и сотрудниками. .^[3] Ввиду этого наблюдения m-значения обычно интерпретируются как пропорциональные dASA. Для ЛЭМ нет физической основы, и он является чисто эмпирическим, хотя он широко используется при интерпретации данных денатурации растворителя. Он имеет общий вид:

${displaystyle Delta G=mleft([D]_{1/2}-[D]ight)}$

где склон ${displaystyle m}$ называется "м-value "(> 0 для приведенного выше определения) и ${displaystyle left[Dight]_{1/2}}$ (также называемый C_м) представляет собой концентрацию денатуранта, при которой происходит сворачивание 50% молекул ( средняя точка денатурации перехода, где ${displaystyle p_{N}=p_{U}=1/2}$).

На практике наблюдаемые экспериментальные данные при различных концентрациях денатуранта соответствуют модели двух состояний с этой функциональной формой для ${displaystyle Delta G}$вместе с линейными базовыми линиями для свернутого и развернутого состояний. В ${displaystyle m}$ и ${displaystyle left[Dight]_{1/2}}$ два подгоночных параметра, а также четыре других параметра для линейных базовых линий (наклон и пересечение для каждой линии); в некоторых случаях предполагается, что наклоны равны нулю, что дает всего четыре подгоночных параметра. Конформационная стабильность ${displaystyle Delta G}$ может быть рассчитан для любой концентрации денатуранта (включая стабильность при нулевом денатуранте) по подобранным параметрам ${displaystyle m}$ и ${displaystyle left[Dight]_{1/2}}$. В сочетании с кинетическими данными сворачивания м-значение может быть использовано для грубой оценки количества скрытой гидрофобной поверхности в переходном состоянии складчатости.

Структурные зонды

К сожалению, вероятности ${displaystyle p_{N}}$ и ${displaystyle p_{U}}$ нельзя измерить напрямую. Вместо этого мы анализируем относительную популяцию свернутых молекул с использованием различных структурных зондов, например, поглощение при 287 нм (который сообщает о воздействии растворителя на триптофан и тирозин ), далеко-ультрафиолетовый круговой дихроизм (180-250 нм, что говорит о вторичной структуре белкового остова), двойная поляризационная интерферометрия (который сообщает размер молекул и плотность складок) и ближний ультрафиолетовый флуоресценция (который сообщает об изменениях в окружающей среде триптофана и тирозина). Однако подойдет практически любой зонд со складчатой ​​структурой; поскольку измерение проводится в состоянии равновесия, нет необходимости в высоком разрешении по времени. Таким образом, можно проводить измерения ЯМР химические сдвиги, характеристическая вязкость, воздействие растворителя (химическая реакционная способность) боковых цепей, таких как цистеин, воздействие протеаз на основную цепь и различные гидродинамические измерения.

Чтобы преобразовать эти наблюдения в вероятности ${displaystyle p_{N}}$ и ${displaystyle p_{U}}$, обычно предполагается, что наблюдаемая ${displaystyle A}$ принимает одно из двух значений, ${displaystyle A_{N}}$ или же ${displaystyle A_{U}}$, соответствующие исходному или развернутому состоянию соответственно. Следовательно, наблюдаемая величина равна линейной сумме

${displaystyle A=A_{N}p_{N}+A_{U}p_{U}}$

Подгоняя наблюдения ${displaystyle A}$ при различных условиях решения этой функциональной формы можно оценить ${displaystyle A_{N}}$ и ${displaystyle A_{U}}$, а также параметры ${displaystyle Delta G}$. Подгоночные переменные ${displaystyle A_{N}}$ и ${displaystyle A_{U}}$ иногда разрешается линейно изменяться в зависимости от условий раствора, например, от температуры или концентрации денатуранта, когда асимптоты из ${displaystyle A}$ наблюдаются линейные изменения в условиях сильного складывания или сильного разворачивания.

Термическая денатурация

Предполагая двухуровневую денатурацию, как указано выше, можно вывести основные термодинамические параметры, а именно: ${displaystyle Delta H}$, ${displaystyle Delta S}$ и ${displaystyle Delta G}$ при условии, что кто-то знает ${displaystyle Delta C_{p}}$ исследуемой системы.

Термодинамические наблюдаемые денатурации можно описать следующими уравнениями:

${displaystyle {egin{aligned}Delta H(T)&=Delta H(T_{d})+int _{T_{d}}^{T}Delta C_{p}dT&=Delta H(T_{d})+Delta C_{p}[T-T_{d}]Delta S(T)&={frac {Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+int _{T_{d}}^{T}Delta C_{p}dln T&={frac {Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+Delta C_{p}ln {frac {T}{T_{d}}}Delta G(T)&=Delta H-TDelta S&=Delta H(T_{d}){frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+int _{T_{d}}^{T}Delta C_{p}dT-Tint _{T_{d}}^{T}Delta C_{p}dln T&=Delta H(T_{d})left(1-{frac {T}{T_{d}}}ight)-Delta C_{p}left[T_{d}-T+Tln({frac {T}{T_{d}}})ight]end{aligned}}}$

куда ${displaystyle Delta H}$, ${displaystyle Delta S}$ и ${displaystyle Delta G}$ указать энтальпия, энтропия и Свободная энергия Гиббса разворачивания при постоянном pH и давлении. Температура, ${displaystyle T}$ варьируется, чтобы исследовать термостойкость системы и ${displaystyle T_{d}}$ это температура, при которой половина молекул в системе развернуты. Последнее уравнение известно как Уравнение Гиббса – Гельмгольца..

Определение теплоемкости белков

В принципе, можно рассчитать все вышеуказанные термодинамические наблюдаемые из одного дифференциальная сканирующая калориметрия термограмма системы в предположении, что ${displaystyle Delta C_{p}}$ не зависит от температуры. Однако получить точные значения для ${displaystyle Delta C_{p}}$ Сюда. Точнее, ${displaystyle Delta C_{p}}$ можно вывести из вариаций ${displaystyle Delta H(T_{d})}$ против. ${displaystyle T_{d}}$ что может быть достигнуто путем измерений с небольшими вариациями pH или же концентрация белка. Наклон линейной аппроксимации равен ${displaystyle Delta C_{p}}$. Обратите внимание, что любая нелинейность точек данных указывает на то, что ${displaystyle Delta C_{p}}$ возможно нет независимо от температуры.

В качестве альтернативы ${displaystyle Delta C_{p}}$ можно также оценить из расчета доступная площадь поверхности (ASA) белка до и после термической денатурации следующим образом:

${displaystyle {ce { Delta ASA=ASA_{unfolded}-ASA_{native}}}}$

Для белков с известной трехмерной структурой ${displaystyle ASA_{native}}$ можно рассчитать с помощью компьютерных программ, таких как Deepview (также известный как швейцарский просмотрщик PDB ). В ${displaystyle ASA_{unfolded}}$ можно рассчитать из табличных значений каждой аминокислоты с помощью полуэмпирического уравнения:

${displaystyle {ce {ASA_{unfolded}}}=a_{{ce {polar}}} imes {ce {ASA_{polar}}}+a_{{ce {aromatic}}} imes {ce {ASA_{aromatic}}}+a_{{ce {non-polar}}} imes {ce {ASA_{non-polar}}}}$

где нижние индексы полярные, неполярные и ароматические указывают части 20 встречающихся в природе аминокислот.

Наконец, для белков существует линейная корреляция между ${displaystyle Delta ASA}$ и ${displaystyle Delta C_{p}}$ через следующее уравнение:^[4]

${displaystyle Delta C_{p}=0.61*Delta {ce {ASA}}}$

Оценка развертывания двух состояний

Кроме того, можно оценить, происходит ли складывание в соответствии с развертыванием в двух состояниях, как описано выше. Это можно сделать с помощью дифференциальная сканирующая калориметрия сравнивая калориметрическую энтальпию денатурации, т.е. площадь под пиком, ${displaystyle A_{ ext{peak}}}$ к энтальпии Ван 'т Гоффа, описываемой следующим образом:

${displaystyle Delta H_{vH}(T)=-R{frac {dln K}{dT^{-1}}}}$

в ${displaystyle T=T_{d}}$ то ${displaystyle Delta H_{vH}(T_{d})}$ можно описать как:

${displaystyle Delta H_{vH}(T_{d})={frac {RT_{d}^{2}Delta C_{p}^{max }}{A_{ ext{peak}}}}}$

Когда наблюдается развертывание двух состояний, ${displaystyle A_{ ext{peak}}=Delta H_{vH}(T_{d})}$. В ${displaystyle Delta C_{p}^{max }}$ - высота пика теплоемкости.

Обобщение на сложные белки

Используя вышеупомянутые принципы, уравнения, которые связывают глобальный белковый сигнал, соответствующий состояниям складывания в равновесии, и переменное значение денатурирующего агента, будь то температура или химическая молекула, были получены для гомомерных и гетеромерных белков, от мономеров до тримеров. и потенциально тетрамеры. Эти уравнения обеспечивают надежную теоретическую основу для измерения стабильности сложных белков и для сравнения стабильности белков дикого типа и мутантных белков.^[5] Такие уравнения не могут быть получены для пентамеров высших олигомеров из-за математических ограничений (теорема Абеля – Руффини).

Другие формы денатурации

Аналогичные функциональные формы возможны для денатурации путем давление,^[6] pH, или применяя силу с атомно-силовой микроскоп кончик.^[7]

Рекомендации

1. Ансон М.Л., Денатурация белков и свойства групп белков, Успехи в химии белков, 2, 361-386 (1945).
2. Шеллманн, Дж. А., Термодинамика обмена растворителей, Биополимеры 34, 1015–1026 (1994).
3. Myers JK, Pace CN, Scholtz JM. Значения денатурирующего m и изменения теплоемкости: связь с изменениями доступных участков поверхности разворачивания белка, Protein Sci. 4 (10), 2138–2148 (1995).
4. Робертсон А.Д., Мерфи К.П. Структура белка и энергетика стабильности белка, (1997), Chem Rev, 97, 1251-1267
5. Бедуель, Хьюг (2016). «Принципы и уравнения для измерения и интерпретации стабильности белка: от мономера до тетрамера». Биохимия. 121: 29–37. Дои:10.1016 / j.biochi.2015.11.013. PMID  26607240.
6. Лассаль, Майкл В .; Акасака, Казуюки (2007). «Использование ядерного магнитного резонанса высокого давления для изучения сворачивания белков». В Бай, Явэн; Нусинов, Рут (ред.). Протоколы сворачивания белков. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр.21–38. ISBN  1-59745-189-4.
7. Ng, Sean P .; Рэндлс, Люси Джи; Кларк, Джейн (2007). «Использование ядерного магнитного резонанса высокого давления для изучения сворачивания белков». В Бай, Явэн; Нусинов, Рут (ред.). Протоколы сворачивания белков. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр.139–167. ISBN  1-59745-189-4.

дальнейшее чтение

• Pace CN. (1975) «Стабильность глобулярных белков», CRC Критические обзоры в биохимии, 1-43.
• Санторо ММ и Болен DW. (1988) «Развертывание изменений свободной энергии, определенных методом линейной экстраполяции. 1. Развертывание фенилметансульфонил-α-химотрипсина с использованием различных денатурантов», Биохимия, 27, 8063-8068.
• Привалов ПЛ. (1992) "Физические основы стабильности свернутых конформаций белков", в Сворачивание белков, Т. Е. Крейтон, ред., У. Х. Фриман, стр. 83–126.
• Яо М. и Болен Д.В. (1995) «Насколько достоверны измерения свободной энергии, вызванной денатурантами? Уровень соответствия общепринятым предположениям по расширенному диапазону стабильности рибонуклеазы А», Биохимия, 34, 3771-3781.
• Джексон С.Е. (1998) «Как складываются небольшие однодоменные белки?», Складывание и дизайн, 3, R81-R91.
• Schwehm JM и Stites WE. (1998) "Применение автоматизированных методов определения конформационной стабильности белков", Методы в энзимологии, 295, 150-170.