Расплав высокого разрешения - High Resolution Melt

Расплав высокого разрешения (HRM) анализ это мощная техника в молекулярная биология для обнаружения мутации, полиморфизмы и эпигенетический различия в двухцепочечная ДНК образцы. Он был обнаружен и разработан компанией Idaho Technology и Университетом штата Юта.[1] Имеет преимущества перед другими генотипирование технологии, а именно:

  • Это рентабельно по сравнению с другими генотипирование такие технологии как последовательность действий и TaqMan Типирование SNP. Это делает его идеальным для крупномасштабных проектов генотипирования.
  • Он быстрый и мощный, что позволяет быстро и точно генотипировать многие образцы.
  • Это просто. С помощью высококачественного HRM-анализа негенетики могут провести мощное генотипирование в любой лаборатории, имеющей доступ к HRM-аппарату для ПЦР в реальном времени.

Метод

HRM-анализ выполняется на образцах двухцепочечной ДНК. Обычно пользователь будет использовать полимеразной цепной реакции (ПЦР) перед анализом HRM для амплификации области ДНК, в которой находится их интересующая мутация. В пробирке с образцом теперь находится много копий интересующей области ДНК. Этот участок, который амплифицируется, известен как ампликон. После процесса ПЦР начинается анализ HRM. Этот процесс представляет собой просто точное нагревание ДНК ампликона от примерно 50 ˚C до примерно 95 ˚C. В какой-то момент во время этого процесса достигается температура плавления ампликона, и две цепи ДНК разделяются или «плавятся».

Плавление ДНК cartoon.jpg

Ключ к HRM - отслеживать это разделение ветвей в реальном времени. Это достигается с помощью флуоресцентного красителя. Красители, которые используются для HRM, известны как интеркалирующие красители и обладают уникальным свойством. Они специфически связываются с двухцепочечной ДНК, и когда они связаны, они ярко флуоресцируют. В отсутствие двухцепочечной ДНК им не с чем связываться, и они флуоресцируют только на низком уровне. В начале HRM-анализа образец имеет высокий уровень флуоресценции из-за миллиардов копий ампликона. Но по мере того, как образец нагревается и две цепи ДНК расплавляются, присутствие двухцепочечной ДНК уменьшается и, таким образом, уменьшается флуоресценция. В HRM-машине есть камера, которая наблюдает за этим процессом, измеряя флуоресценцию. Затем машина просто строит эти данные в виде графика, известного как кривая плавления, показывающего уровень флуоресценции в зависимости от температуры:

Сценатическая кривая плавления ДНК.jpg

Сравнение кривых плавления

Температура плавления ампликона, при которой две нити ДНК расходятся, вполне предсказуема. Это зависит от последовательности оснований ДНК. Если вы сравниваете два образца, полученные от двух разных людей, они должны дать точно такую ​​же форму кривой плавления. Однако, если у одного человека есть мутация в области ДНК, которую вы амплифицировали, то это изменит температуру, при которой нити ДНК расплавляются. Итак, теперь две кривые плавления выглядят разными. Разница может быть лишь незначительной, возможно, доли градуса, но поскольку HRM-машина имеет возможность отслеживать этот процесс в «высоком разрешении», можно точно задокументировать эти изменения и, следовательно, определить, присутствует ли мутация или нет. .

Схема плавления ДНК 2.jpg

Дикий тип, гетерозигота или гомозигота?

Все становится немного сложнее, потому что организмы содержат два (или больше ) копии каждого гена, известные как два аллели. Таким образом, если образец взят у пациента и амплифицирован с помощью ПЦР, обе копии интересующей области ДНК (аллели) амплифицируются. Итак, если мы ищем мутацию, есть три возможности:

  1. Ни один из аллелей не содержит мутации
  2. Тот или иной аллель содержит мутацию
  3. Оба аллеля содержат мутацию.

Эти три сценария известны как «Дикий тип», «Гетерозигота» или «Гомозигота» соответственно. Каждый дает кривую плавления, которая немного отличается. С помощью высококачественного анализа HRM можно различить все три сценария.

Гомозиготные аллельные варианты можно охарактеризовать по температурному сдвигу на полученной кривой плавления, полученной с помощью HRM-анализа. Для сравнения, гетерозиготы характеризуются изменением формы кривой плавления. Это происходит из-за несовпадения пар оснований, возникающего в результате дестабилизированного отжига гетеродуплекса между цепями дикого типа и вариантными цепями. Эти различия можно легко увидеть на полученной кривой плавления, а различия в профилях плавления между разными генотипами можно усилить визуально, построив кривую различия. [2]

График STD HRM.JPG

Приложения

Типирование SNP / обнаружение точечных мутаций

Общепринятый SNP Методы типирования обычно трудоемки и дороги, требуя объединения нескольких анализов на основе зондов или использования микрочипов ДНК. HRM более экономичен и снижает необходимость в разработке нескольких пар праймеров и необходимости покупать дорогие зонды. Метод HRM был успешно использован для обнаружения единственной замены G на A в гене Vssc (Voltage Sensitive Sodium Channel), который придает устойчивость к акарициду. перметрин чесоточного клеща. Эта мутация приводит к изменению кодирования белка (G1535D). Анализ чесоточных клещей, собранных из популяций с подозрением на восприимчивость и толерантность к перметрину, с помощью HRM показал различные профили плавления. В ампликоны от чувствительных клещей наблюдалась более высокая температура плавления по сравнению с толерантными клещами, как и ожидалось из-за более высокой термостабильности GC базовая пара [3]

В области, более соответствующей клинической диагностике, было показано, что HRM в принципе подходит для обнаружения мутаций в генах предрасположенности к раку молочной железы BRCA1 и BRCA2. В этих генах идентифицировано более 400 мутаций.
Секвенирование генов - золотой стандарт выявления мутаций. Секвенирование занимает много времени и трудозатратно, и ему часто предшествуют методы, используемые для идентификации гетеродуплексной ДНК, которые затем усиливают эти проблемы. HRM предлагает более быстрый и удобный метод закрытой пробирки для оценки наличия мутаций и дает результат, который может быть дополнительно исследован, если он представляет интерес. В исследовании, проведенном Scott et al. в 2006 г.[4] Для оценки методологии HRM использовали 3 клеточные линии, несущие различные мутации BRCA. Было обнаружено, что профили плавления полученных продуктов ПЦР можно использовать для различения наличия или отсутствия мутации в ампликоне. Аналогичным образом в 2007 году Krypuy et al.[5] показали, что тщательный дизайн HRM-анализов (в отношении размещения праймеров) может быть успешно использован для обнаружения мутаций в гене TP53, который кодирует белок-супрессор опухоли p53 в клинических образцах рака груди и яичников. Оба этих исследования подчеркнули тот факт, что изменения в профиле плавления могут быть в виде сдвига температуры плавления или очевидного различия в форме кривой плавления. Оба эти параметра являются функцией последовательности ампликона. По общему мнению, HRM является экономически эффективным методом, который можно использовать в качестве начального скрининга для образцов, подозреваемых в наличии полиморфизмов или мутаций. Это уменьшило бы количество образцов, которые необходимо исследовать более традиционными методами.

Тест на зиготность

В настоящее время существует множество методов определения зиготность статус гена в определенном локусе. Эти методы включают использование ПЦР со специально разработанными зондами для обнаружения вариантов генов (простейшим случаем является типирование SNP). В случаях, когда речь идет о более длительных вариациях, может потребоваться анализ ампликонов после ПЦР. Можно измерить изменения в ферментативном ограничении, электрофоретическом и хроматографическом профилях. Эти методы обычно требуют больше времени и увеличивают риск заражения ампликонов в лаборатории из-за необходимости работать с высокими концентрациями ампликонов в лабораторных условиях после ПЦР. Использование HRM сокращает время, необходимое для анализа, и риск загрязнения. HRM - более экономичное решение, а элемент с высоким разрешением позволяет не только определять гомо и гетерозиготность, он также разрешает информацию о типе гомо- и гетерозиготности, при этом разные варианты генов приводят к различным формам кривой плавления. Исследование Gundry et al. 2003 г.,[6] показало, что флуоресцентная маркировка одного праймера (в паре) оказалось более предпочтительным по сравнению с использованием интеркалирующего красителя, такого как SYBR зеленый I. Однако был достигнут прогресс в разработке и использовании улучшенных интеркалирующих красителей. [7] которые уменьшают проблему ингибирования ПЦР и опасения по поводу ненасыщающей интеркаляции красителя.

Эпигенетика

Методология HRM также использовалась для обеспечения надежного анализа метилирование статус ДНК. Это важно, поскольку изменения в статусе метилирования генов-супрессоров опухолей, генов, которые регулируют апоптоз и репарация ДНК являются характеристиками рака, а также имеют значение для ответа на химиотерапию. Например, больные раком могут быть более чувствительны к лечению ДНК-алкилирующие агенты если промотор гена репарации ДНК MGMT пациента метилирован. В исследовании, которое проверило статус метилирования MGMT промотор на 19 образцах толстой кишки, 8 образцов были метилированы.[8] Другое исследование сравнивало предсказательную силу MGMT метилирование промотора у 83 пациентов с глиомой высокой степени злокачественности, полученное либо MSP, пиросеквенирование, и HRM. Было обнаружено, что метод HRM по крайней мере эквивалентен пиросеквенированию при количественном определении уровня метилирования.[9]

Метилированная ДНК может быть обработана би-сульфитной модификацией, которая преобразует неметилированные цитозины в урацил. Следовательно, продукты ПЦР, полученные из матрицы, которая изначально была неметилированной, будут иметь более низкую температуру плавления, чем продукты, полученные из метилированной матрицы. HRM также предлагает возможность определения доли метилирования в данном образце, сравнивая ее со стандартной кривой, которая создается путем смешивания различных соотношений метилированной и неметилированной ДНК. Это может предоставить информацию о степени метилирования, которое может иметь опухоль, и, таким образом, дать представление о характере опухоли и о том, насколько далеко он отклоняется от того, что является «нормальным».

HRM также практически полезен для использования в диагностике из-за его способности адаптироваться к высокопроизводительному скрининговому тестированию, и, опять же, он сводит к минимуму возможность распространения ампликонов и контаминации в лаборатории благодаря своему формату закрытой пробирки.

Интеркалирующие красители

Чтобы проследить переход дцДНК (двухцепочечная) в оцДНК (одноцепочечную), используются интеркалирующие красители. Эти красители демонстрируют дифференциальное излучение флуоресценции в зависимости от их ассоциации с двухцепочечной или одноцепочечной ДНК. SYBR Зеленый I краситель первого поколения для HRM. Он флуоресцирует при интеркаляции в дцДНК, а не в оцДНК. Поскольку он может ингибировать ПЦР при высоких концентрациях, он используется при концентрациях ниже уровня насыщения. В последнее время некоторые исследователи не рекомендуют использовать SYBR Green I для HRM,[10] утверждая, что требуются существенные изменения протокола. Это связано с тем, что предполагается, что отсутствие точности может быть результатом «прыжка красителя», когда краситель из расплавленного дуплекса может повторно включиться в области дцДНК, которые еще не расплавились.[6][10] Новые насыщающие красители, такие как LC Green и LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy и SYTO 9, доступны на рынке и успешно используются для HRM. Однако некоторые группы успешно использовали SYBR Green I для HRM с инструментами Corbett Rotorgene. [11] и выступать за использование SYBR Green I в приложениях HRM.

Разработка экспериментов по плавлению с высоким разрешением

Анализы плавления с высоким разрешением обычно включают амплификацию кПЦР с последующим построением кривой плавления с использованием флуоресцентного красителя. Из-за чувствительности анализа плавления с высоким разрешением необходимо тщательно учитывать условия цикла ПЦР, качество ДНК-матрицы и параметры кривой плавления.[12] Для получения точных и повторяемых результатов условия термоциклирования ПЦР должны быть оптимизированы, чтобы гарантировать, что желаемый участок ДНК амплифицируется с высокой специфичностью и минимальным смещением между вариантами последовательностей. Кривая плавления обычно строится в широком диапазоне температур небольшими (~ 0,3 ° C) приращениями, которых достаточно (~ 10 секунд) для достижения ДНК равновесия на каждом температурном шаге.

Помимо типичных грунтовка По соображениям дизайна, дизайн праймеров для анализов плавления с высоким разрешением включает максимальное увеличение термодинамических различий между продуктами ПЦР, принадлежащими к разным генотипам. Меньшие ампликоны обычно дают больший разброс температуры плавления, чем более длинные ампликоны, но эту вариабельность невозможно предсказать на глаз. По этой причине очень важно точно предсказать кривую плавления продуктов ПЦР при разработке праймеров, которые будут различать варианты последовательностей. Специальное программное обеспечение, такое как uMelt[13] и ДизайнПодпись,[14] доступны для помощи в разработке праймеров, которые максимально увеличивают вариабельность кривой плавления, особенно для анализов плавления с высоким разрешением.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Для академической обработки истории HRM см. http://www.dna.utah.edu/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html
  2. ^ S Taylor et al., 2010. Практическое руководство по генотипированию с помощью анализа расплава с высоким разрешением. BioRad Tech Note 6004.
  3. ^ Пасай С., Арлиан Л., Морган М. и др. (Март 2008 г.). «Анализ расплава с высоким разрешением для обнаружения мутации, связанной с устойчивостью к перметрину, в популяции чесоточных клещей». Med. Вет. Энтомол. 22 (1): 82–8. Дои:10.1111 / j.1365-2915.2008.00716.x. PMID  18380658.
  4. ^ Джеймс П.А., Доэрти Р., Харрис М. и др. (Февраль 2006 г.). «Оптимальный отбор людей для тестирования мутации BRCA: сравнение доступных методов». J. Clin. Онкол. 24 (4): 707–15. Дои:10.1200 / JCO.2005.01.9737. PMID  16446345.
  5. ^ Krypuy M, Ahmed AA, Etemadmoghadam D, et al. (2007). «Плавление с высоким разрешением для сканирования мутаций 5-8 экзонов TP53». BMC Рак. 7: 168. Дои:10.1186/1471-2407-7-168. ЧВК  2025602. PMID  17764544.
  6. ^ а б Гандри С.Н., Вандерштин Дж. Г., Рид Г. Х., Прайор Р. Дж., Чен Дж., Виттвер Коннектикут (март 2003 г.). «Анализ плавления ампликона с помеченными праймерами: метод в закрытой пробирке для дифференциации гомозигот и гетерозигот». Clin. Chem. 49 (3): 396–406. Дои:10.1373/49.3.396. PMID  12600951.
  7. ^ Виттвер, Коннектикут, Рид Г.Х., Гандри С.Н., Вандерштин Дж. Г., Прайор Р. Дж. (Июнь 2003 г.) «Генотипирование с высоким разрешением с помощью анализа плавления ампликонов с использованием LCGreen». Clin. Chem. 49 (6 Pt 1): 853–60. Дои:10.1373/49.6.853. PMID  12765979.
  8. ^ Войдач Т.К., Добрович А. (2007). «Чувствительное к метилированию плавление с высоким разрешением (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования». Нуклеиновые кислоты Res. 35 (6): e41. Дои:10.1093 / нар / гкм013. ЧВК  1874596. PMID  17289753.
  9. ^ Switzeny, Olivier J .; Кристманн, Маркус; Ренованц, Мирьям; Гизе, Альф; Зоммер, Клеменс; Каина, Бернд (05.05.2016). «Метилирование промотора MGMT, определенное с помощью HRM по сравнению с MSP и пиросеквенированием для прогнозирования ответа глиомы высокой степени». Клиническая эпигенетика. 8: 49. Дои:10.1186 / s13148-016-0204-7. ISSN  1868-7083. ЧВК  4858829. PMID  27158275.
  10. ^ а б Рид Г. Х., Кент Дж. О., Виттвер Коннектикут (июнь 2007 г.). «Анализ плавления ДНК с высоким разрешением для простой и эффективной молекулярной диагностики». Фармакогеномика. 8 (6): 597–608. Дои:10.2217/14622416.8.6.597. PMID  17559349. как PDF
  11. ^ Pornprasert S, Phusua A, Suanta S, Saetung R, Sanguansermsri T (июнь 2008 г.). «Обнаружение типа альфа-талассемии-1 из Юго-Восточной Азии с использованием гэп-ПЦР в реальном времени с SYBR Green1 и анализа плавления с высоким разрешением». Евро. J. Haematol. 80 (6): 510–4. CiteSeerX  10.1.1.509.2403. Дои:10.1111 / j.1600-0609.2008.01055.x. PMID  18284625.
  12. ^ Монтгомери Дж. Л., Сэнфорд Л. Н., Виттвер Коннектикут (2010). «Анализ плавления ДНК с высоким разрешением в клинических исследованиях и диагностике». Эксперт Рев Мол Диаг. 10 (2): 219–240. Дои:10.1586 / erm.09.84. PMID  20214540.
  13. ^ Дуайт Z, Palais R, Wittwer CT (2011). «uMELT: прогнозирование кривых плавления с высоким разрешением и динамических профилей плавления продуктов ПЦР в многофункциональном веб-приложении». Биоинформатика. 27 (7): 1019–1020. Дои:10.1093 / биоинформатика / btr065. PMID  21300699.
  14. ^ Райт ES, Вецигиан KH (2016). «DesignSignatures: инструмент для создания праймеров, который дает ампликоны с различными сигнатурами». Биоинформатика. 32 (10): 1565–1567. Дои:10.1093 / биоинформатика / btw047. PMID  26803162.

внешняя ссылка