Иммуномечение - Immunolabeling

Иммуномечение - определение антигена в ткани с помощью меченых антиген-специфических антител

Иммуномечение это биохимический процесс, который позволяет обнаруживать и локализовать антиген к определенному участку внутри клетки, ткани или органа. Антигены - это органические молекулы, обычно белки, способный привязать к антитело. Эти антигены можно визуализировать с использованием комбинации антиген-специфических антител, а также средства обнаружения, называемого меткой, которая ковалентно связана с антителом.[1] Если процесс иммунного маркирования предназначен для выявления информации о клетке или ее субструктурах, этот процесс называется иммуноцитохимия.[2] Иммуномечение более крупных структур называется иммуногистохимия.[3]

Производство антител для иммуномечения состоит из двух сложных этапов. Первый производит антитело, которое специфически связывается с интересующим антигеном, а второй - слияние метки с антителом. Поскольку нецелесообразно слить метку со всеми возможными антиген-специфическими антителами, в большинстве процессов иммуномечения используется косвенный метод обнаружения. Этот косвенный метод использует первичное антитело это антигенспецифический и вторичное антитело слит с меткой, которая специфически связывает первичное антитело. Этот непрямой подход позволяет массовое производство вторичных антител, которые можно купить с полки.[4] В соответствии с этим непрямым методом в тест-систему добавляется первичное антитело. Первичное антитело ищет и связывается с антигеном-мишенью. Затем добавляют помеченное вторичное антитело, предназначенное для прикрепления исключительно к первичному антителу.

Типичные теги включают: флуоресцентный состав, золотые бусины, особый эпитоп тег,[5] или фермент который производит окрашенное соединение. Связывание меток с мишенью через антитела обеспечивает идентификацию и визуализацию интересующего антигена в его естественном местоположении в ткани, таком как клеточная мембрана, цитоплазма, или же ядерная мембрана. При определенных условиях метод может быть адаптирован для получения количественной информации.[4]

Иммуномечение можно использовать в фармакология, молекулярная биология, биохимия и в любой другой области, где важно знать точное местоположение молекулы, связывающейся с антителом.[6][7][8]

Косвенный и прямой метод

Есть два метода иммунной метки: прямой и непрямой. В прямом методе иммуномечения первичное антитело конъюгировано непосредственно с меткой.[9] Прямой метод полезен для минимизации перекрестная реакция, показатель неспецифичности, присущий всем антителам и умножаемый на каждое дополнительное антитело, используемое для обнаружения антигена. Однако прямой метод гораздо менее практичен, чем непрямой, и обычно не используется в лабораториях, поскольку первичные антитела должны быть ковалентно помечены, что требует большого количества очищенных антител. Кроме того, прямой метод потенциально гораздо менее чувствителен, чем косвенный метод.[10] Поскольку несколько вторичных антител способны связываться с разными частями или доменами одного первичного антитела, связывающего целевой антиген, с каждым антигеном связано больше меченых антител. Больше метки на антиген приводит к большему количеству сигнала на антиген.[11]

Для достижения высокой степени специфичности и чувствительности можно использовать различные непрямые методы. Во-первых, часто используются двухэтапные протоколы, чтобы избежать перекрестной реакции между иммуномечением нескольких первичное и вторичное антитело смеси, где вторичные фрагмент антигенсвязывающий часто используются антитела. Во-вторых, можно использовать гаптенилированные первичные антитела, где вторичное антитело может распознавать ассоциированные гаптен. Гаптен ковалентно связан с первичным антителом посредством сукцинил имидестеры или сопряженные IgG Fc -специфический Fab разделы. Наконец, первичный моноклональные антитела которые имеют разные изотипы Ig, могут быть обнаружены специфическими вторичными антителами, которые против изотип представляет интерес.[10]

Связывание антител и специфичность

В целом антитела должны связываться с антигены с высокой специфичностью и сродством.[12] Специфичность связывания относится к способности антитела связывать и связывать только один антиген-мишень. Ученые обычно используют моноклональные антитела и поликлональные антитела, которые состоят из синтетических пептидов. Во время производства этих антител антигенспецифические антитела изолируются путем присоединения антигенного пептида к столбец соответствия и позволяя неспецифическим антителам просто проходить через колонку. Это снижает вероятность связывания антител с нежелательным эпитоп антигена, не обнаруженного в исходном пептиде. Следовательно, специфичность антитела устанавливается путем специфической реакции с белком или пептидом, который используется для иммунизации с помощью определенных методов, таких как иммуноблоттинг или же иммунопреципитация.[13]

При установлении специфичности антител ключевым фактором является тип используемых синтетических пептидов или очищенных белков. Чем меньше специфичность антитела, тем больше вероятность визуализации чего-то, кроме антигена-мишени. В случае синтетических пептидов преимуществом является аминокислота последовательность легко доступна, но пептиды не всегда напоминают трехмерную структуру или посттрансляционная модификация находится в нативной форме белка. Следовательно, антитела, которые вырабатываются для работы против синтетического пептида, могут иметь проблемы с нативным 3-D белком. Эти типы антител могут привести к плохим результатам иммунопреципитации или иммуногистохимия эксперименты, однако антитела могут быть способны связываться с денатурированной формой белка во время цикла иммуноблоттинга. Напротив, если антитело хорошо работает с очищенными белками в их нативной форме, а не денатурированный, иммуноблот не может использоваться в качестве стандартизированного теста для определения специфичности связывания антител, особенно в иммуногистохимии.[14]

Специфические методы иммуномечения

Иммуномечение для световой микроскопии

Свет микроскопия это использование оптический микроскоп, который представляет собой инструмент, требующий использования света для просмотра увеличенного образца. Как правило, часто используется составной световой микроскоп, в котором две линзы, окуляр и цель работать одновременно, чтобы получить увеличение образца.[15] В световой микроскопии часто используется иммунная метка для наблюдения за тканями или клетками-мишенями. Например, было проведено исследование для изучения морфологии и выработки гормонов в культурах клеток аденомы гипофиза с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии. Этот тип микроскопии подтвердил, что первичные культуры клеток аденомы сохраняют свои физиологические характеристики. in vitro, что соответствует гистологическому исследованию. Более того, культуры клеток аденомы гипофиза человека просматривали с помощью световой микроскопии и иммуноцитохимии, где эти клетки фиксировали и иммуно метили моноклональным мышиным антителом против человеческого GH и поликлональным кроличьим антителом против PRL. Это пример того, как иммуномеченая клеточная культура клеток аденомы гипофиза, которую просматривали с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии, может помочь в правильной диагностике опухолей.[16]

Иммуномечение для электронной микроскопии

Электронная микроскопия (EM) - это специализированная область науки, в которой используются электронный микроскоп как инструмент для просмотра тканей.[17] Электронная микроскопия имеет увеличение до 2 миллионов раз, тогда как световая микроскопия имеет увеличение только до 1000-2000 раз.[18] Есть два типа электронных микроскопов: просвечивающий электронный микроскоп и растровый электронный микроскоп.[17]

Электронная микроскопия - это распространенный метод, в котором используется метод иммуномечения для просмотра меченых тканей или клеток. Метод электронного микроскопа следует многим из тех же концепций, что и иммуномечение для световой микроскопии, когда конкретное антитело способно распознавать местоположение интересующего антигена, а затем рассматриваться в электронном микроскопе. Преимущество электронной микроскопии перед световой микроскопией заключается в возможности просматривать целевые области на их субклеточном уровне. Обычно для ЭМ используется тяжелый металл с электронной плотностью, который может отражать падающие электроны. Иммуномечение обычно подтверждают с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться в наличии антигена, а затем прослеживают с помощью электронного микроскопа.[19]

Иммуномечение и электронная микроскопия часто используются для просмотра хромосомы. Было проведено исследование для просмотра возможных улучшений структур хромосом с иммунной меткой, таких как топоизомераза IIα и конденсин в разрезе митотический хромосомы. В частности, эти исследователи использовали УФ-облучение разделенных ядер или показали, как хромосомы помогают с помощью высоких уровней специфической иммунной метки, которые наблюдались с помощью электронной микроскопии.[20]

Иммуномечение для просвечивающей электронной микроскопии

Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) использует просвечивающий электронный микроскоп для формирования двухмерного изображения путем выстрела электронов через тонкий кусок ткани. Чем ярче определенные области на изображении, тем больше электронов может пройти через образец.[17] Просвечивающая электронная микроскопия использовалась как способ просмотра иммуномеченных тканей и клеток. Например, бактерии можно увидеть с помощью ТЕА, когда применяется иммунная метка. Было проведено исследование для изучения структур CS3 и CS6. фимбрии в разных кишечная палочка штаммы, которые были обнаружены с помощью ПЭМ с последующим отрицательным окрашиванием и иммуномечением. Более конкретно, иммуномечение фимбрий подтвердило существование различных поверхностных антигенов.[21]

Иммуномечение для сканирующей электронной микроскопии

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) использует сканирующий электронный микроскоп, который создает большие изображения, которые воспринимаются как трехмерные, хотя на самом деле это не так. Этот тип микроскопа концентрирует пучок электронов на очень небольшой площади (2-3 нм) образца для получения электронов из указанного образца. Эти вторичные электроны обнаруживаются датчиком, и изображение образца создается в течение определенного периода времени.[17]

Сканирующая электронная микроскопия - часто используемый метод иммуномечения. СЭМ способен обнаруживать поверхность клеточных компонентов с высоким разрешением. Этот метод иммунофлуоресценции очень похож на метод иммунофлуоресценции, но вместо флуорофора используется метка из коллоидного золота. В целом концепции очень похожи в том, что используется неконъюгированное первичное антитело, за которым последовательно следует помеченное вторичное антитело, которое работает против первичного антитела.[22] Иногда SEM в сочетании с иммуномечением золотых частиц вызывает затруднения в отношении разрешения частиц и зарядов под электронным лучом; тем не менее, это снижение разрешения было устранено за счет улучшения аппаратуры SEM с помощью формирования изображений обратно рассеянных электронов.[23] Это связано с тем, что дифракционные картины обратного рассеяния электронов обеспечивают чистую поверхность образца для взаимодействия с первичным электронным пучком.[24]

Иммуномаркировка золотом (Immunogold Labeling)

Иммуномечение частицами золота, также известное как окрашивание иммунным золотом, регулярно используется со сканирующей электронной микроскопией и просвечивающей электронной микроскопией, чтобы успешно идентифицировать области в клетках и тканях, где расположены антигены.[23] Методика мечения золотыми частицами была впервые опубликована Фолком, В. и Тейлором, Г., когда они смогли пометить частицы золота против гамма-глобулинов кролика против сальмонеллы за один шаг, чтобы определить местоположение антигенов сальмонеллы.[23][25]

Исследования показали, что размер частицы золота должен быть увеличен (> 40 нм), чтобы рассматривать клетки при малом увеличении, но слишком большие частицы золота могут снизить эффективность связывания золотой метки. Ученые пришли к выводу, что использование более мелких частиц золота (1-5 нм) должно быть увеличено и усилено серебром. Хотя окрашивание тетроксидом осмия может поцарапать серебро, было обнаружено, что усиление золотых частиц не чувствительно к царапинам из-за окрашивания четырехокиси осмия; Таким образом, во многих исследованиях клеточной адгезии различных субстратов можно использовать механизм мечения иммуноголотом за счет усиления частиц золота.[26]

Рекомендации

  1. ^ Hyatt, A.D., & Wise, T.G. (2001). «Иммуномечение». Иммуноцитохимия и гибридизация in situ в биомедицинских науках - Глава 5 - Иммуномечение. Бостон, Массачусетс: Birkhauser Boston. С. 73–107. Дои:10.1007/978-1-4612-0139-7_5. ISBN  978-1-46-12-0139-7.
  2. ^ Нанси А., Вазен Р., Нишио С., Залзал С.Ф. (2008). «Иммуноцитохимия матричных белков в кальцифицированных тканях: функциональная биохимия в разделе». Eur J Histochem. 52 (4): 201–14. Дои:10.4081/1218. PMID  19109094.
  3. ^ Swanson PE (сентябрь 1988 г.). «Основы иммуногистохимии. Практический обзор». Являюсь. J. Clin. Патол. 90 (3): 333–9. Дои:10.1093 / ajcp / 90.3.333. PMID  3046324.
  4. ^ а б Rapley R, Walker JM, ред. (2008). Справочник по молекулярным биометодам (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. п. 1066. ISBN  978-1-60327-370-1.
  5. ^ Панг Дж, Цзэн Х, Сяо Р.П., Лакатта Э.Г., Линь Л. (июнь 2009 г.). «Разработка, создание и тестирование модулей экспрессии млекопитающих, которые маркируют мембранные белки». Белковая наука. 18 (6): 1261–71. Дои:10.1002 / pro.136. ЧВК  2774436. PMID  19472344.
  6. ^ Рангелл Л.К., Келлер Г.А. (август 2000 г.). «Применение микроволновой технологии для обработки и иммуномаркировки пластиковых и криосрезов». Журнал гистохимии и цитохимии. 48 (8): 1153–9. Дои:10.1177/002215540004800812. PMID  10898808.
  7. ^ Малецки М., Хсу А., Чыонг Л., Санчес С. (январь 2002 г.). «Молекулярное иммуномечение антителами с рекомбинантным одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), созданными с использованием металлсвязывающих доменов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 99 (1): 213–8. Bibcode:2002ПНАС ... 99..213М. Дои:10.1073 / pnas.261567298. ЧВК  117541. PMID  11756693.
  8. ^ Хейкок Дж. В. (сентябрь 1989 г.). «Количественное определение тирозингидроксилазы, уровни белка: точечное иммуномечение с аффинно-очищенным антителом». Аналитическая биохимия. 181 (2): 259–66. Дои:10.1016/0003-2697(89)90240-6. PMID  2573292.
  9. ^ Чендлер, Дуглас Э .; Роберсон, Роберт В. (2009). Биоимиджинг: современные концепции световой и электронной микроскопии. Садбери, Массачусетс: издательство «Джонс и Бартлетт». п. 311. ISBN  978-0-7637-3874-7.
  10. ^ а б Бухвалов И.Б., Минин Е.А., Беккер В. (2005). «Техника многоцветного флуоресцентного иммуноокрашивания для одновременного нацеливания на антигены». Acta Histochem. 107 (2): 143–8. Дои:10.1016 / j.acthis.2005.01.003. PMID  15950054.
  11. ^ Рамос-Вара Ж.А. (июль 2005 г.). «Технические аспекты иммуногистохимии». Вет. Патол. 42 (4): 405–26. Дои:10.1354 / вп.42-4-405. PMID  16006601. S2CID  6229029.
  12. ^ Кумагай И., Цумото К. (19 апреля 2010 г.). Связывание антиген-антитело. eLS. С. 1–7. Дои:10.1002 / 9780470015902.a0001117.pub2. ISBN  978-0470016176.
  13. ^ Burry RW (февраль 2000 г.). «Контроль специфичности иммуноцитохимических методов». J. Histochem. Cytochem. 48 (2): 163–6. Дои:10.1177/002215540004800201. PMID  10639482.
  14. ^ Bordeaux J, Welsh A, Agarwal S, Killiam E, Baquero M, Hanna J, Anagnostou V, Rimm D (март 2010 г.). «Проверка антител». Биотехнологии. 48 (3): 197–209. Дои:10.2144/000113382. ЧВК  3891910. PMID  20359301.
  15. ^ Мерфи, Дуглас Б. Дэвидсон; Майкл В. (2013). Основы световой микроскопии и электронной визуализации (Второе изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley and Sons, Inc., стр. 1-2. ISBN  978-0-471-69214-0.
  16. ^ Fazekas I, Hegedüs B, Bácsy E, et al. (2005). «Характеристика аденом гипофиза человека в клеточных культурах с помощью световой и электронной микроскопии морфологии и иммунной метки». Folia Histochemica et Cytobiologica. 43 (2): 81–90. PMID  16044945.
  17. ^ а б c d Рассел, Джон Дж. Боззола; Лонни Д. (1999). Электронная микроскопия: принципы и методы для биологов (2-е издание) (2-е изд.). Садбери, штат Массачусетс [u.a.]: Джонс и Бартлетт. С. 5 и 9. ISBN  978-0-7637-0192-5.
  18. ^ Ким, Оливер (22 января 2009 г.). «Электронные микроскопы против оптических (световых) микроскопов». Журнал Microbehunter Microscopy. Получено 2013-05-04.
  19. ^ Джордж, Эндрю Дж. Т.; Urch, Екатерина Е. (2000). Диагностические и терапевтические антитела. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. С. 439–452. ISBN  9781592590766.
  20. ^ Маэшима К., Ельцов М., Лэммли УК (ноябрь 2005 г.). «Хромосомная структура: улучшенная иммунная метка для электронной микроскопии» (PDF). Хромосома. 114 (5): 365–75. Дои:10.1007 / s00412-005-0023-7. PMID  16175370. S2CID  14768368.
  21. ^ Люди С., Фрей Дж., Фавр Д., Стоффель М. Х. (апрель 2006 г.). «Оценка экспрессии энтеротоксигенных поверхностных антигенов, специфичных для Escherichia coli, в рекомбинантных штаммах с помощью просвечивающей электронной микроскопии и иммуномечения». J. Histochem. Cytochem. 54 (4): 473–7. Дои:10.1369 / jhc.5A6794.2005. PMID  16344328.
  22. ^ Гольдберг М.В. (2008). Иммуномечение для сканирующей электронной микроскопии (SEM) и автоэмиссионного SEM. Методы Cell Biol. Методы клеточной биологии. 88. С. 109–30. Дои:10.1016 / S0091-679X (08) 00407-X. ISBN  9780123743206. PMID  18617031.
  23. ^ а б c Россо Ф, Папале Ф, Барбариси А (2013). «Экологическая сканирующая электронная микроскопия, иммуномечение золота в клеточной биологии». Методы клеточной визуализации. Методы молекулярной биологии. 931. С. 517–23. Дои:10.1007/978-1-62703-056-4_27. ISBN  978-1-62703-055-7. PMID  23027021.
  24. ^ Нараянан Б.К., Коварик Л., Кинтана М.А., Миллс М.Дж. (2013). «Характеристика ферритных микроструктур сварных швов с использованием различных методов электронной микроскопии: обзор». Наука и технология сварки и соединения. 16 (1): 12–22. Дои:10.1179 / 136217110X12720264008312. ISSN  1362-1718. S2CID  135581795.
  25. ^ Фолк В.П., Тейлор GM (ноябрь 1971 г.). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия. 8 (11): 1081–3. Дои:10.1016/0019-2791(71)90496-4. PMID  4110101.
  26. ^ Оуэн Г.Р., Мередит Д.О., Ап Гвинн I, Ричардс Р.Г. (2001). «Увеличение участков фокальной адгезии, меченных иммунным золотом, в фибробластах, культивируемых на металлических подложках: проблемы и решения». Cell Biol. Int. 25 (12): 1251–9. Дои:10.1006 / cbir.2001.0846. PMID  11748918.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Иммуномаркировка