DnaG - DnaG

ДНК-примаза
Идентификаторы
ОрганизмКишечная палочка К-12 подл. MG1655, Bacillus stearothermophilus
СимволДНК
Альт. символыdnaP
Entrez947570
PDB1D0Q, 1DD9, 1DDE, 1EQ9, 2R6A, 2R6C
RefSeq (Prot)NP_417538
UniProtP0ABS5
Прочие данные
Номер ЕС2.7.7.7
Хромосомахромосома: 3,21 - 3,21 Мб

DnaG это бактериальный ДНК прима и кодируется ДНК ген. Фермент DnaG, как и любая другая ДНК-примаза, синтезирует короткие цепи РНК известный как олигонуклеотиды в течение Репликация ДНК. Эти олигонуклеотиды известны как грунтовки потому что они служат отправной точкой для синтеза ДНК. DnaG катализирует синтез олигонуклеотидов от 10 до 60 нуклеотиды (основная единица ДНК и РНК) длинные, однако большинство синтезированных олигонуклеотидов составляют 11 нуклеотидов.[1] Эти олигонуклеотиды РНК служат праймерами или отправными точками для синтеза ДНК бактериальными бактериями. ДНК-полимераза III (Pol III). DnaG важен для репликации бактериальной ДНК, поскольку ДНК-полимераза не может инициировать синтез цепи ДНК, а может только добавлять нуклеотиды к уже существующей пряди.[2] DnaG синтезирует одиночный праймер РНК на начало репликации. Этот праймер служит для грунтовки ведущая нить Синтез ДНК. Для другой родительской нити отстающая нить, DnaG синтезирует праймер РНК каждые несколько килобазы (КБ). Эти праймеры служат субстратами для синтеза Фрагменты Окадзаки.[3]

В Кишечная палочка DnaG связывается посредством нековалентных взаимодействий с бактериальным репликативом. геликаза DnaB для выполнения своей активности примазы с тремя белками примазы DnaG, связанными с каждой геликазой DnaB, чтобы сформировать примосома.[4] Примазы, как правило, инициируют синтез определенных трех нуклеотидных последовательностей на матрицах одноцепочечной ДНК (оцДНК) и для Кишечная палочка DnaG последовательность 5'-CTG-3 '.[1]

DnaG содержит три отдельных белковые домены: домен связывания цинка, домен полимеразы РНК и домен связывания геликазы DnaB. Есть несколько бактерий, которые используют ДНК-примазу DnaG. Некоторые организмы, имеющие DnaG в качестве ДНК-примазы, являются кишечная палочка (Кишечная палочка), Bacillus stearothermophilus, и Микобактерии туберкулеза (MTB). E. coli DnaG имеет молекулярную массу 60 килодальтон (кДа) и содержит 581 кДа. аминокислоты.

Функция

DnaG (ДНК-примаза) - важный фермент, участвующий в репликационной вилке ДНК.
Органический механизм олигонуклеотидного синтеза рибонуклеиновой кислоты (РНК) в направлении от 5 'до 3'

DnaG катализирует синтез олигонуклеотидов в пять дискретных шагов: связывание с матрицей, нуклеозидтрифосфат (NTP) связывание, инициация, удлинение с образованием праймера и перенос праймера на ДНК-полимеразу III.[1] DnaG выполняет этот катализ рядом с вилка репликации который образуется геликазой DnaB во время репликации ДНК. DnaG должен образовывать комплекс с DnaB для того, чтобы катализировать образование олигонуклеотидных праймеров.[1]

Механизм синтеза праймеров примазами включает два сайта связывания NTP на белке примазы (DnaG).[5] Перед связыванием любых NTP с образованием праймера РНК матричная последовательность оцДНК связывается с DnaG. ОцДНК содержит трехнуклеотидную последовательность узнавания, которая рекрутирует NTP на основе Базовая пара Уотсона-Крика.[1] После связывания ДНК DnaG должен связывать два NTP, чтобы образовать четвертичный комплекс фермент-ДНК-NTP-NTP. Константа Михаэлиса (км) для NTP варьируется в зависимости от примазы и шаблонов.[6] Два сайта связывания NTP на DnaG называются сайтом инициации и сайтом элонгации. Сайт инициации - это сайт, с которым связывается NTP, который должен быть включен на 5'-конце праймера. Сайт удлинения связывает NTP, который добавлен к 3'-концу праймера.

Как только два нуклеотида связываются с примазой, DnaG катализирует образование динуклеотида, образуя фосфодиэфирную связь через дегидратационный синтез между 3'-гидроксилом нуклеотида в сайте инициации и α-фосфатом нуклеотида в сайте элонгации. Эта реакция приводит к образованию динуклеотида и разрыву связи между α и β фосфором с высвобождением пирофосфата. Эта реакция необратима, поскольку образующийся пирофосфат гидролизуется ферментом на две молекулы неорганического фосфата. неорганическая пирофосфатаза.[7] Эта реакция синтеза динуклеотидов аналогична реакции любого другого фермента, который катализирует образование ДНК или РНК (ДНК-полимераза, РНК-полимераза ), поэтому DnaG всегда должен синтезировать олигонуклеотиды в направлении от 5 'до 3'. В Кишечная палочкапраймеры начинаются с динуклеотида трифосфат-аденин-гуанина (pppAG) на 5'-конце.

Чтобы произошло дальнейшее удлинение динуклеотида, олигонуклеотид должен быть перемещен таким образом, чтобы 3'-NTP переносился с сайта элонгации на сайт инициации, позволяя другому NTP связываться с сайтом элонгации и присоединяться к 3'-гидроксилу олигонуклеотид. После того, как олигонуклеотид соответствующей длины был синтезирован на стадии элонгации синтеза праймера, DnaG переносит вновь синтезированный праймер на ДНК-полимеразу III, чтобы он синтезировал ведущую цепь ДНК или фрагменты Окадзаки для отстающей цепи.[1] Этап ограничения скорости синтеза праймера происходит после связывания NTP, но до или во время синтеза динуклеотидов.[6]

Структура

Согласно исследованиям протеолиза, примаза DnaG E. Coli представляет собой мономерный белок из 581 остатка с тремя функциональными доменами. Существует N-концевой цинк-связывающий домен (остатки 1-110), в котором ион цинка тетраэдрически координирован между одним гистидином и тремя остатками цистеина, который играет роль в распознавании сайтов связывания ДНК, специфичных для последовательности. Центральный домен (остатки 111-433) проявляет активность РНК-полимеразы и является местом синтеза праймера РНК. С-концевой домен (остатки 434-581) отвечает за нековалентное связывание DnaG с DnaB геликаза белок.[8]

Цинк-связывающий домен

Слева: структура Bacillus stearothermophilus цинк-связывающий домен с консервативными гидрофобными и основными остатками, показанными серебром. Справа: увеличенное изображение сайта связывания цинка, на котором показаны Cys40, Cys61, Cys64 и His43, координирующие ион цинка. Диаграмма отрисована из PDB 1D0Q.

Цинк-связывающий домен, домен, ответственный за распознавание участков связывания ДНК, специфичных для последовательности, является консервативным для всех вирусных, бактериофаговых, прокариотических и эукариотических ДНК-примаз.[9] Цинк-связывающий домен примазы является частью подсемейства цинк-связывающие домены известный как цинковая лента. Ленточные цинковые домены характеризуются двумя β-шпилька петли, которые образуют цинк-связывающий домен. Обычно считается, что домены из цинковой ленты не имеют α-спирали, что отличает их от других цинк-связывающих доменов. Однако в 2000 году цинк-связывающий домен DnaG был кристаллизован из Bacillus stearothermophilus обнаруживая, что домен состоит из пятицепочечного антипараллельного β лист рядом с четырьмя α-спиралями и 310 спираль на c-конце домена.[9]

Цинк-связывающий сайт B. stearothermophilus состоит из трех остатков цистеина, Cys40, Cys61 и Cys64, и одного остатка гистидина, His43. Cys40 и His43 расположены на β-шпильке между вторым и третьим β-листом.[9] Cys61 расположен на пятом β-листе, а Cys64 находится на β-шпильке между четвертым и пятым β-листом. Эти четыре остатка тетраэдрически координируют ион цинка. Считается, что ион цинка стабилизирует петли между вторым и третьим β-слоями, а также четвертым и пятым β-слоями. Домен дополнительно стабилизируется за счет ряда гидрофобных взаимодействий между гидрофобной внутренней поверхностью β-листа, который упакован относительно второй и третьей α-спиралей. Внешняя поверхность β-листа также имеет много консервативных гидрофобных и основных остатков. Эти остатки представляют собой Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 и Phe62.[9]

Связывание ДНК

Считается, что цинк-связывающий домен предназначен для распознавания специфической последовательности ДНК. Примазы ДНК создают праймеры РНК, которые затем используются для синтеза ДНК. Размещение праймеров РНК не случайно, что позволяет предположить, что они размещены на определенных последовательностях ДНК. Действительно, было показано, что другие ДНК-примазы распознают триплетные последовательности; конкретная последовательность, распознаваемая B. stearothermophilus еще не идентифицирован.[9] Было показано, что если остатки цистина, координирующие ион цинка, мутируют, ДНК-примаза перестает функционировать. Это указывает на то, что цинк-связывающий домен действительно играет роль в распознавании последовательности. Кроме того, гидрофобная поверхность β-листа, а также основные остатки, которые сгруппированы в основном на одном крае листа, служат для привлечения однонитевой ДНК, дополнительно облегчая связывание ДНК.[9]

Основываясь на предыдущих исследованиях связывания ДНК с помощью ДНК-примаз, считается, что ДНК связывается с цинк-связывающим доменом на поверхности β-листа, при этом три нуклеотида связываются через три цепи β-листа.[9] Положительно заряженные остатки в листе могли бы образовывать контакты с фосфатами, а ароматические остатки могли бы образовывать стэкинг-взаимодействия с основаниями. Это модель связывания ДНК оцДНК-связывающим доменом белок репликации А (RPA).[9] Логично предположить, что B. stearothermophilus ’ цинк-связывающий домен связывает ДНК аналогичным образом, поскольку остатки, важные для связывания ДНК в RPA, находятся в структурно эквивалентных положениях в B. stearothermophilus.[9]

РНК-полимеразный домен

Структура Кишечная палочка РНК-полимеразный домен DnaG. Высококонсервативные основные остатки Arg146, Arg221 и Lys229 показаны желтым. Это изображение было создано из PDB 1DD9.

Как следует из названия, домен РНК-полимеразы (RNAP) DnaG отвечает за синтез праймеров РНК на одноцепочечной ДНК. In-vivo DnaG может синтезировать праймерные фрагменты длиной до 60 нуклеотидов, но фрагменты праймеров in-vivo ограничены примерно 11 нуклеотидами.[10] Во время синтеза отстающая нить DnaG синтезирует от 2000 до 3000 праймеров со скоростью один праймер в секунду.[10]

RNAP-домен DnaG имеет три субдомена, N-концевой домен, который имеет смешанную α- и β-складку, центральный домен, состоящий из 5-ти нитевого β-листа и 6 α-спиралей, и, наконец, C-концевой домен, который состоит из а спиральный пучок состоящий из 3-х антипараллельных α-спиралей. Центральный домен состоит из части верхняя складка, складка, которая наблюдалась у многих металл-связывающих белков фосфопереноса. Центральный домен и N-концевой домен образуют неглубокую щель, которая составляет активный сайт удлинения цепи РНК в DnaG.[10] Открытие щели выстлано несколькими высококонсервативными основными остатками: Arg146, Arg221 и Lys229. Эти остатки являются частью электростатически положительного гребня N-концевого субдомена. Именно этот гребень взаимодействует с оцДНК и помогает направлять ее в щель, которая состоит из центра связывания металла мотива топрима в центральном субдомене и консервативных мотивов примазы N-концевого домена.[10] Сайт связывания металла топрим-домена - это место, где синтезируется праймер. Затем дуплекс РНК: ДНК проходит через еще одну базовую депрессию.

C-Терминальный домен

Структура E. Coli's связывающий домен геликазы. Сделано из PDB 2R6A. Две нижние спирали образуют спиральную шпильку субдомена C2. Остальные пять спиралей образуют спиральный пучок субдомена C1.

В отличие от цинк-связывающих доменов и доменов РНК-полимеразы, С-концевые домены ДНК-примаз не консервативны. В прокариотических примазах единственная известная функция этого домена - взаимодействие с геликазой, DnaB.[1] Таким образом, этот домен называется доменом связывания геликазы (HBD). HBD DnaG состоит из двух субдоменов: спиральный пучок, субдомен C1 и спиральная шпилька, субдомен C2.[4][11] Для каждой из двух-трех молекул DnaG, которые связывают гексамер DnaB, субдомены C1 HBD взаимодействуют с DnaB в его N-концевых доменах на внутренней поверхности гексамерного кольца, в то время как субдомены C2 взаимодействуют с N-концевыми доменами. на внешней поверхности гексамера.

Bacillus stearothermophilus DnaG, синий, в комплексе с гексамерным DnaB, зеленый. Сделано из PDB 2R6A

Три остатка в B. stearothermophilus DnaB были определены как важные для формирования интерфейса DnaB, DnaG. Эти остатки включают Tyr88, Ile119 и Ile125.[4] Tyr88 находится близко к HBD DnaG, но не контактирует с ним. Мутация Tyr88 ингибирует образование спирального пучка N-концевого домена DnaB, прерывая контакты с HBD DnaG.[4] Гексамерная структура DnaB представляет собой тример димеров. И Ile119, и Ile125 скрыты в интерфейсе димера N-концевого домена DnaB, и мутация этих остатков ингибирует образование гексамерной структуры и, следовательно, взаимодействие с DnaG.[4] Еще один остаток, который, как было установлено, играет решающую роль во взаимодействии DnaB и DnaG, - это Glu15. Мутация Glu15 не нарушает формирование комплекса DnaB, DnaG, но вместо этого играет роль в модулировании длины праймеров, синтезируемых DnaG.[4]

Подавление DnaG

Аналоги NTP, которые, как известно, ингибируют DnaG, а также другие ферменты полимеразы

Ингибиторы ДНК-примаз являются ценными соединениями для выяснения биохимических путей и ключевых взаимодействий, но они также представляют интерес как соединения свинца разработать препараты против бактериальных заболеваний. Большинство соединений, которые, как известно, ингибируют примазы, являются аналоги нуклеотидов такие как AraATP (см. Видарабин ) и 2-фтор-АраАТФ. Эти соединения часто будут использоваться праймазой в качестве субстратов, но после включения синтез или удлинение больше не могут происходить. Например, Кишечная палочка DnaG будет использовать 2 ', 3'-дидезоксинуклеозид 5'-трифосфаты (ddNTP) в качестве субстратов, которые действуют как терминаторы цепи из-за отсутствия 3'-гидроксила для образования фосфодиэфирной связи со следующим нуклеотидом.[1]

Относительно небольшое количество ингибиторов примазы, вероятно, отражает сложность, присущую анализам примазы, а не отсутствие потенциальных сайтов связывания на ферменте. Короткая длина синтезируемых продуктов и, как правило, низкая скорость фермента по сравнению с другими ферментами репликации делают развитие высокопроизводительный скрининг (HTS) подходит сложнее.[6] Несмотря на трудности, существует несколько известных ингибиторов DnaG, не являющихся аналогами NTP. Доксорубицин и сурамин являются конкурентными ингибиторами ДНК и NTP Микобактерии туберкулеза DnaG.[12] Также известно, что сурамин ингибирует примазу ДНК эукариот, конкурируя с GTP, поэтому сурамин, вероятно, ингибирует DnaG посредством аналогичного механизма.[1]

внешняя ссылка

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я Фрик Д. Н., Ричардсон СС (2001). «ДНК-примаза». Ежегодный обзор биохимии. 70: 39–80. Дои:10.1146 / annurev.biochem.70.1.39. PMID  11395402. S2CID  33197061.
  2. ^ Рассел П. (2009). iGenetics: молекулярный подход (3-е изд.). Бенджамин Каммингс. С. 42–43. ISBN  978-0321772886.
  3. ^ Нельсон Д., Кокс М. (2008). Принципы биохимии Ленингера (5-е изд.). Нью-Йорк: W.H. Фримен и компания. стр.986–989. ISBN  978-0716771081.
  4. ^ а б c d е ж Бейли С., Элиасон В.К., Стейтц Т.А. (19 октября 2007 г.). «Структура гексамерной DnaB-геликазы и ее комплекса с доменом DnaG-примазы». Наука. 318 (5849): 459–63. Дои:10.1126 / science.1147353. PMID  17947583.
  5. ^ Фрик Д. Н., Кумар С., Ричардсон С. К. (10 декабря 1999 г.). «Взаимодействие рибонуклеозидтрифосфатов с примазой гена 4 бактерифага Т7». Журнал биологической химии. 274 (50): 35899–907. Дои:10.1074 / jbc.274.50.35899. PMID  10585475.
  6. ^ а б c Кучта Р.Д., Стенгель Г. (май 2010 г.). «Механизм и эволюция ДНК-примаз». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Белки и протеомика. 1804 (5): 1180–9. Дои:10.1016 / j.bbapap.2009.06.011. ЧВК  2846230. PMID  19540940.
  7. ^ Брюс П.Й. (2007). Органическая химия (5-е изд.). Pearson Education, Inc., стр. 1202–1203. ISBN  978-0-13-199631-1.
  8. ^ Воет, Дональд (2010). Биохимия (4-е изд.). Нью-Йорк: J. Wiley & Sons. п.1189. ISBN  978-0-470-57095-1.
  9. ^ а б c d е ж грамм час я Pan H, Wigley DB (15 марта 2000 г.). «Структура цинк-связывающего домена ДНК-примазы Bacillus stearothermophilus». Структура. 8 (3): 231–9. Дои:10.1016 / S0969-2126 (00) 00101-5. PMID  10745010.
  10. ^ а б c d Кек Дж. А., Рош Д. Д., Линч А. С., Бергер Дж. М. (31 марта 2000 г.). «Структура РНК-полимеразного домена примазы E. coli». Наука. 287 (5462): 2482–6. Дои:10.1126 / science.287.5462.2482. PMID  10741967. S2CID  27005599.
  11. ^ Окли А.Дж., Лоша К.В., Шеффер П.М., Лиепиньш Э., Пинтакуда Г., Вилс М.С., Оттинг Дж., Диксон Н.Э. (15 января 2005 г.). «Кристаллическая структура и структура раствора геликазо-связывающего домена кишечная палочка Primase ». Журнал биологической химии. 280 (12): 11495–11504. Дои:10.1074 / jbc.M412645200. PMID  15649896.
  12. ^ Бисвас Т., Ресто-Ролдан Э, Сойер С.К., Арцимович И., Цодиков О.В. (декабрь 2012 г.). «Новый нерадиоактивный анализ активности примазы-пирофосфатазы и его применение для открытия ингибиторов примазы DnaG Mycobacterium tuberculosis». Исследования нуклеиновых кислот. 41 (4): e56. Дои:10.1093 / нар / gks1292. ЧВК  3575809. PMID  23267008.