Синхронизация ячеек - Cell synchronization

Синхронизация ячеек это процесс, посредством которого клетки в культуре на разных стадиях клеточный цикл доводятся до той же фазы. Синхронизация клеток - это жизненно важный процесс при изучении клеток, проходящих клеточный цикл, поскольку она позволяет собирать данные в масштабах всей популяции, а не полагаться исключительно на эксперименты с одной клеткой. Типы синхронизации можно разделить на две группы; физическое фракционирование и химическая блокада.

Физическое разделение

Физическое фракционирование - это процесс, с помощью которого непрерывно делящиеся клетки разделяются на популяции, обогащенные фазами, на основе таких характеристик, как следующие:

• Плотность клеток
• Размер ячейки
• Наличие клеточной поверхности эпитопы отмечено антитела
• Рассеяние света
• Флуоресцентный эмиссия меченых клеток.

Учитывая, что клетки приобретают различную морфологию и поверхностные маркеры на протяжении клеточного цикла, эти признаки можно использовать для разделения по фазам. Обычно используются два метода.

Центробежное отмывание

(Ранее называлось: противоточное центрифугирование) Центробежный отмучивание может использоваться для разделения клеток в разных фазах клеточного цикла в зависимости от их размера и скорости оседания (связанных с коэффициент седиментации ). Благодаря постоянным моделям роста на протяжении клеточного цикла, отмучивание в центрифуге может разделять клетки на G1, S, G2, и M фазы за счет увеличения размера (и увеличения коэффициентов седиментации) с уменьшенным разрешением между фазами G2 и M из-за клеточной гетерогенности и отсутствия отчетливого изменения размера.^[1]

Более крупные клетки оседают быстрее, поэтому клетка в G2, которая пережила большее время роста, оседает быстрее, чем клетка в G1, и поэтому ее можно фракционировать. Клетки, выращенные в суспензии, легче отмучиваются, поскольку они не слипаются друг с другом и имеют округлую однородную форму. Однако некоторые типы прикрепленных клеток можно лечить трипсин и ресуспендированы для отмучивания, так как в суспензии они принимают более округлую форму.^[2]

Проточной цитометрии и Сортировка ячеек

Проточной цитометрии позволяет обнаруживать, подсчитывать и измерять физические и химические свойства клеток. Клетки суспендируют в жидкости и пропускают через проточный цитометр. Клетки отправляются по одной через лазерный луч, а светорассеяние измеряется детектором. Клетки или их компоненты могут быть помечены флуоресцентными маркерами, чтобы они испускали свет с разной длиной волны в ответ на лазер, что позволяет собирать дополнительные данные.

Для количественного анализа клеточного цикла клетки обычно фиксируют этанолом и окрашивают ДНК-связывающими красителями, такими как иодид пропидия, Hoechst 33342, DAPI, 7-аминоактиномизин D, Митрамицин, DRAQ5, или TO-PRO-3, что позволяет определять фазу по количеству ДНК.^[3] Однако, если эти клетки были зафиксированы, они мертвы и не могут поддерживаться для дальнейшего роста. Клетки также можно ресуспендировать в среде и окрашивать нетоксичными красителями для сохранения живых культур. Клетки также могут быть геном отредактирован так что некоторые клеточные белки сделаны с конъюгированными флуоресцентными метками, такими как GFP, мЧерри, и Люцифераза которые можно использовать для обнаружения и количественной оценки этих компонентов. Например, химерный гистон H2B -GFP-конструкции могут быть созданы и использованы для измерения содержания ДНК и определения статуса репликации как средства распознавания клеточной фазы.^[4] Измерения светорассеяния можно использовать для определения таких характеристик, как размер, что позволяет различать фазы клеток без маркировки.

Проточные цитометры могут использоваться для сбора данных многопараметрической цитометрии, но не могут использоваться для разделения или очистки клеток. Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) - это метод сортировки клеток на основе различий, которые можно обнаружить по светорассеянию (например, по размеру клеток) или флуоресцентному излучению (проникновение ДНК, РНК, белков или антигенов). Система работает так же, как проточная цитометрия, но также заряжает каждую каплю клетки после ее измерения на основе определенного параметра. Заряженная капля тогда встретит электростатическое отклонение система, которая отсортирует ячейку в другой контейнер на основе этого заряда. Это позволяет разделять клетки на основе флуоресцентного содержания или разброса.

Подводя итог, можно использовать только проточную цитометрию для сбора количественных данных о распределении фаз клеточного цикла, но проточную цитометрию в координации с FACS можно использовать для сбора количественных данных и разделения клеток по фазам для дальнейшего изучения. Ограничения включают:

• для измерения светорассеяния плохое разрешение между G2 и M (как при центробежном отмучивании)
• для фиксированных клеток, неспособных поддерживать живые культуры
• для незакрепленных, но окрашенных клеток, возможное нарушение или мутагенез клеток из-за обработки красителем
• может сохраняться некоторая гетерогенность популяции, поскольку разделение по размеру не всегда может быть точным для измерения фазы, и не все клетки могут находиться в одной и той же точке в каждой фазе (ранний G1 против позднего G1)
• для клеток, редактируемых ДНК, процесс может занять продолжительное время.

Химическая блокада

Добавление экзогенный субстраты могут использоваться для блокировки клеток в определенных фазах клеточного цикла и часто нацелены контрольные точки клеточного цикла. Эти методы можно проводить in vitro и не требуют удаления из культуральной среды. Наиболее распространенный тип химической блокады - это остановка и высвобождение, который включает обработку культуры химическим блоком и последующее высвобождение путем промывки или добавления нейтрализующего агента для блока. Хотя химическая блокада обычно более эффективна и точна, чем физическое разделение, некоторые методы могут быть несовершенными по разным причинам, в том числе:

• доля синхронизированных ячеек недостаточна
• химические манипуляции могут нарушить клеточную функцию и / или убить часть клеток
• лечение токсично и неприменимо in vivo (актуально только при рассмотрении клинического применения)^[3]

Арест в М

Митотическая остановка может быть достигнута с помощью многих методов и в различных точках в М-фазе, включая переход G2 / M, переход метафаза / анафаза и выход из митоза.

Нокодазол

Нокодазол - быстро обратимый ингибитор микротрубочка полимеризация которые можно использовать для остановки клеток перед Анафаза на КПП шпиндельной сборки в переходе метафаза / анафаза. Яд микротрубочек работает, блокируя образование митотические веретена которые прикрепляются и разрываются сестринские хроматиды в делящихся клетках. Клетки останутся заблокированными до тех пор, пока нокодазол не будет вымыт. Нокодазол, по-видимому, не нарушает межфазный метаболизм, и высвободившиеся клетки возвращаются к нормальному развитию клеточного цикла.^[5] Поскольку микротрубочки жизненно важны для других клеточных функций, длительное использование нокодазола может привести к нарушению этих функций, вызывая гибель клеток.

Подавление CDK1

CDK1 необходим для перехода из фазы G2 в фазу M. RO-3306 - это селективный ингибитор CDK1, который может обратимо задерживать клетки на границе G2 / M. RO-3306 синхронизировал> 95% циклических клеток (включая раковые), и высвободившиеся клетки быстро вступают в митоз.^[6]

Росковитин

Росковитин можно использовать для подавления активности циклин-зависимые киназы (CDK), конкурируя с АТФ в АТФ-связывающей области киназы. Его эффекты являются мощными, они задерживают клетки, подавляя функцию CDK, необходимую для развития клеточного цикла. Росковитин можно использовать для остановки клеток при переходах G0 / G1, G1 / S или G2 / M.^[7]

Колхицин

Колхицин задерживает клетки в метафазе и является ядом микротрубочек, предотвращающим образование митотического веретена, во многом подобно нокодазолу. Работает путем деполимеризации тубулин в микротрубочках, блокируя продвижение к анафазе за счет длительной остановки в КПП шпиндельной сборки.

Арест в S (арест G1 / S)

Арест в фазе S обычно включает подавление Синтез ДНК поскольку геном реплицируется. Большинство методов обратимы путем промывания.

Двойной тимидин блокировать

Высокие концентрации тимидина прерывают путь метаболизма дезоксинуклеотидов через конкурентное торможение, таким образом блокируя Репликация ДНК. Однократная обработка тимидином останавливает клетки на протяжении S-фазы, поэтому двойная обработка вызывает более однородный блок в ранней S-фазе.^[8] Процесс начинается с обработки тимидином, промывания культуры, после чего следует еще одна обработка тимидином.

Гидроксимочевина

Гидроксимочевина снижает выработку дНТФ путем ингибирования фермента рибонуклеотидредуктаза. Это останавливает синтез ДНК, лишая ДНК-полимераза дНТФ на вилки репликации.^[9] Гидроксимочевина также используется для лечения некоторых видов рака и заболеваний крови.

Афидиколин

Афидоколин - это тетрациклический препарат грибкового происхождения. дитерпеноид который действует как селективный ингибитор ДНК-полимераза α.^[10] Этот фермент необходим для репликативного синтеза ДНК, но не нарушает репарационный синтез ДНК или репликацию митохондриальной ДНК.^[11]

Арест в G1

Существует единственный обычно используемый химический метод для синхронизации клеток в G1. Это включает в себя Ловастатин, обратимый конкурентный ингибитор 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А-редуктаза, фермент, жизненно важный для производства мевалоновая кислота. Мевалоновая кислота является ключевым промежуточным звеном в мевалонатный путь отвечает за синтез холестерин. Добавление холестерина к клеткам, обработанным ловастатином, не отменяет аффект ареста, поэтому ловастатин, по-видимому, ингибирует образование некоторых ранних промежуточных звеньев пути, которые необходимы для прогрессирования через ранний G1.^[12]

Другие методы синхронизации

Митотический отбор

Митотический отбор - это безлекарственная процедура отбора митотических клеток из монослоя, подвергающегося экспоненциальному росту.^[13] Во время митоза клетки претерпевают изменения в морфологии, и митотический отбор использует это преимущество в прикрепленных клетках, выращенных в монослой. Клетки становятся более сферическими, уменьшая площадь поверхности клеточной мембраны, прикрепленной к культуральной пластине. Таким образом, митотические клетки могут быть полностью отделены осторожным встряхиванием и собраны с супернатант.^[3]

Лишение питательных веществ / сыворотки

Устранение сыворотка от питательная среда в течение примерно 24 часов приводит к накоплению клеток при переходе между г₀ покой и ранний G1. Эта остановка легко обратима путем добавления сыворотки или лишенного питательного вещества. При высвобождении прогрессирование клеточного цикла варьируется, поскольку некоторые клетки остаются неподвижными, в то время как другие проходят клеточный цикл с переменной скоростью.^[14]

Контактное запрещение

Контактное ингибирование происходит, когда клеткам дают возможность расти до высокого или полного слияния, максимизируя межклеточный контакт. Это вызывает остановку на ранних стадиях G1 в нормальных клетках. Арест отменяется заменой ячеек с более низкой плотностью.^[14] Из-за мутаций, способствующих пролиферации, присущих раку, линии опухолевых клеток обычно не способны подвергаться контактному ингибированию, хотя есть исключения.^[15]

внешние ссылки

• Протокол синхронизации ячеек

использованная литература

1. Keng, PC (сентябрь 1980 г.). «Синхронизация опухолевых клеток головного мозга крысы 9L с помощью центробежного отмучивания». Биофизика клетки. 2 (3): 191–206. Дои:10.1007 / BF02790449. PMID  6159093.
2. Крек, Вильгельм (1995). Методы в энзимологии. Elsevier Inc., стр. 114–124.
3. Банфальви Г. (2011) Обзор клеточной синхронизации. В: Банфальви Г. (ред.) Синхронизация клеточного цикла. Методы в молекулярной биологии (методы и протоколы), том 761. Humana Press.
4. Coquelle, А; и другие. (30 ноября 2006 г.). «Обогащение несинхронизированных клеток в фазах G1, S и G2 клеточного цикла для изучения апоптоза». Биохимическая фармакология. 72 (11): 1396–1404. Дои:10.1016 / j.bcp.2006.04.014. PMID  16765323.
5. Зиев, Гэри У .; Тернбулл, Дебора; Маллинз, Дж. Майкл; Макинтош, Дж Ричард (апрель 1980 г.). «Производство большого количества митотических клеток млекопитающих с использованием обратимого ингибитора микротрубочек нокодазол: митотические клетки накапливаются нокодазолом». Экспериментальные исследования клеток. 126 (2): 397–405. Дои:10.1016/0014-4827(80)90279-7. PMID  6153987.
6. Василев, Любомир Т (8 ноября 2006 г.). «Синхронизация клеточного цикла на границе фазы G2 / M посредством обратимого ингибирования CDK1». Клеточный цикл. 5 (22): 2555–2556. Дои:10.4161 / cc.5.22.3463 - через Taylor & Francis Online.
7. Azevedo, W. F .; Leclerc, S .; Meijer, L .; Havlicek, I .; Стрнад, М .; Ким, С. Х. (1997). «Ингибирование циклин-зависимых киназ пуриновыми аналогами: кристаллическая структура человеческого cdk2 в комплексе с росковитином». Евро. J. Biochem. 243: 518–526. Дои:10.1111 / j.1432-1033.1997.0518a.x. PMID  9030780.
8. Г. Банфальви (редактор), Синхронизация клеточного цикла, Методы молекулярной биологии, 761, DOI 10.1007 / 978-1-61779-182-6_10, © Springer Science + Business Media, LLC 2011
9. Коч, Ахмет; Уиллер, Линда Дж .; Мэтьюз, Кристофер К .; Меррилл, Гэри Ф. (21 октября 2003 г.). «Гидроксимочевина останавливает репликацию ДНК с помощью механизма, который сохраняет базальные пулы dNTP». Журнал биологической химии. 279: 223–230. Дои:10.1074 / jbc.m303952200. PMID  14573610.
10. Нагано, Н; Икегами, S (ноябрь 1980 г.). «Афидиколин: специфический ингибитор эукариотической ДНК-полимеразы альфа». Сэйкагаку: журнал японского биомедицинского общества. 52 (11): 1208–1216. PMID  6790638.
11. Sala, F .; Galli, M. G .; Леви, М .; Burroni, D .; Parisi, B .; Педрали-Ной, Г .; Спадари, С. (1981). «Функциональные роли растительных альфа-подобных и гамма-полимераз ДНК». FEBS Lett. 124: 112–118. Дои:10.1016/0014-5793(81)80064-6.
12. Кейомарси, Хандан; Сандовал, Лару; Band, Vilma; Парди, Артур Б. (1 июля 1991 г.). «Синхронизация опухолевых и нормальных клеток от G1 до множественных клеточных циклов с помощью ловастатина». Исследования рака. 51 (13): 3602–3609. PMID  1711413.
13. «Отбор митотических клеток». Биологический онлайн-словарь. 3 октября 2005 г.
14. Дэвис, Пенни К.; Хо, Алан; Дауди, Стивен Ф (июнь 2001 г.). "Биологические методы синхронизации клеточного цикла клеток млекопитающих". Биотехнологии. 30 (3): 1322–1331.
15. Цзэн, Ци; Хун, Ваньцзинь (11 марта 2008 г.). «Возникающая роль пути бегемота в ингибировании контакта с клетками, контроле размера органов и развитии рака у млекопитающих». Раковая клетка. 13 (3): 188–192. Дои:10.1016 / j.ccr.2008.02.011. PMID  18328423.